ジーントラップ・マイクロアレイによるマウス・ゲノムの網羅的な機能解析

使用基因捕获微阵列对小鼠基因组进行综合功能分析

基本信息

批准号：
14011231
负责人：
石田靖雅
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

マウスのES細胞とレトロウイルス型ジーントラップ・ベクターRET(改良型poly Aトラップ方式を採用)を利用してランダムなジーントラップを行い、約1400のES細胞コロニーをピックアップした。それぞれのES細胞クローンからRNAを抽出し、3'RACE法によりトラップされた遺伝子のcDNA断片を増幅したあと、direct sequencingによってその塩基配列を決定した。現在、その塩基配列の情報に基づき、それぞれの遺伝子に特異的なPCRプライマーを合成し、3'RACE法によって得られたものよりさらに純度の高いcDNA断片を増幅しつつ、microarrayの作製を進めている。これと並行して、トラップされた遺伝子の塩基配列に関する情報を整理・分類することにより、「NAISTrapデータベース」を樹立し、インターネットを通して一般に公開した(http://bsw3.aist-nara.ac.jp/kawaichi/naistrap.html)。外部機関の研究者でも、このデータベースを閲覧することにより、自らが関心を持つ遺伝子がノックアウトされたES細胞クローンが申請者のグループのES細胞ストックの中にあるかどうか検索することが可能になった。申請者のグループは、アカデミック分野からのリクエストには無条件で応じる方針である。さらに、本研究で樹立された多数のES細胞クローンが多能性(pluripotency)を保持し続けていることを証明するため、GABA(C)受容体rho-3サブユニット遺伝子がトラップされたES細胞クローンを一例に用いてノックアウト・マウスの作製を試み、それに成功した。

使用小鼠ES细胞和逆转录病毒基因陷阱载体RET进行随机基因陷阱（采用改进的聚A陷阱方法），并挑选了大约1,400 ES细胞菌落。从每个ES细胞克隆中提取RNA，通过3'race方法扩增了捕获基因的cDNA片段，并通过直接测序确定碱基序列。目前，基于基础序列的信息，合成了针对每个基因的PCR引物，并且正在制备微阵列，同时放大纯度纯度甚至比3'race方法获得的cDNA片段更高。同时，通过组织和分类有关被困基因核苷酸序列的信息，建立了“ Naistrap数据库”，并通过Internet（http://bsw3.aist-nara.ac.jp/kawaichi/kawaichi/naistrap.html）公开提供。通过查看此数据库，来自外部机构的研究人员还可以搜索申请人组中淘汰感兴趣基因的ES细胞克隆。申请人组旨在无条件对学术领域的要求做出反应。此外，为了证明本研究中建立的众多ES细胞克隆继续保留多能性，我们试图使用与GABA（C）受体Rho-3亚基基因捕获的ES Clone创建基因敲除小鼠，并成功地执行了这一点。