動物モデルを用いた脳アルツハイマー病変進展過程の検討

点击翻译按钮获取中文摘要

我々は、瀰漫性老人斑におけるβアミロイド沈着の超微形態学的研究から、形質膜の一部分にβタンパクが異常集積して沈着を開始することを報告した。この膜の特定部分と脂質ラフトとの関係を明らかにしたいと考え、本年度は免疫電顕で正常脳の脂質ラフトを形態学的に捉えることを目的に実験を行った。正常ラット(10週齢)を4% formaldehyde + 0.2% glutaraldehyde固定液で潅流し、取りだした脳をさらに同固定液に浸潤固定した。Vibratomeで40μmに薄切後、flotillin-1抗体を反応させ、さらに(1)HRP標識第二抗体とDAB反応、または(2)金標識第二抗体(ナノプローブ)と銀増感で可視化した。岩下らの開発したコレステロールに富む膜ドメインのマーカーであるBCθ(限定分解後ビオチニル化により無毒化したコレステロール結合毒素)は、(1)アビジンHRP+DABまたは(2)アビジン金(ナノプローブ)+銀増感で可視化した。さらに両者の二重染色を行った。その結果、flotillin-1抗体は、神経細胞などの細胞表面形質膜に沿って点状に陽性反応が散在した。この反応は神経細胞の胞体や太い樹状突起、軸索には少なく、オリジンを同定できないようなニューロピルの小突起や軸索終末の形質膜に多く出現する傾向を認めた。この陽性反応の大きさは50-300nm程度であり、文献的にいわれている脂質ラフトの大きさに一致した。BCθも類似の所見を示したが、flotillin-1より多くの膜部位で染まる傾向があった。カベオラのようなフラスコ状の陽性構造物(pit)は見られなかった。細胞質内では、flotillin-1はER、Golgi近傍、リポフスチン顆粒などに反応がみられた。BCθでは細胞質内の染まりは不良であった。二重染色では、flotillin-1とBCθ陽性部位の重なりが高頻度に見られた。このようにコレステロール濃度の高い部位に特異的に結合するBCθとflotillin-1抗体が同様な染色パターンを示すことから、flotillin-1陽性の点状構造物は脂質ラフトと判断された。Flotillin-1をマーカーとすることで脂質ラフトを電顕下で可視化できた。今後は、APPトランスジェニックマウス(Tg9576)を用い、βアミロイド沈着と脂質ラフトの関係を研究したい。