抗腫瘍活性を高めるエフェクター細胞および樹状細胞の選択的増幅法の開発

开发效应细胞和树突状细胞的选择性扩增方法以增强抗肿瘤活性

• 批准号: 14030017
• 负责人: 長棟 輝行
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14030017/
• 关键词: 樹状細胞; 抗体; 受容体; 遺伝子治療; がん; 選択的増幅; 細胞障害性T細胞

本研究では、生体内で免疫原性のない小分子に応答して増殖シグナルを伝達するキメラ受容体を作製することを目指した。小分子としてフルオレセイン(Fl)を選び、抗Fl抗体の可変領域一本鎖抗体(ScFv)を合成ヒト抗体cDNA libraryからphage display法で得た。続いて、エリスロポエチン受容体(EpoR)のEpo結合ドメインを抗Fl抗体のScFvで置換し、その細胞内ドメインをIL-6受容体β鎖であるgp130、IL-2Rβ鎖、IL-2Rγ鎖、c-kitで置換したキメラ受容体(それぞれScFv-gp130,ScFv-IL-2Rβ、ScFv-IL-2Rγ、ScFv-kit)発現レトロウィルスベクターを作製した。目的遺伝子のモデルとして緑色蛍光タンパク質EGFPを選び、キメラ受容体の下流に内部リボソーム結合部位(IRES)配列を介して連結した。これらのベクターをIL-3依存性血球細胞株であるBa/F3細胞に導入し、Fl標識BSA(BSA-Fl)を添加して培養したところ、細胞増殖が生じたことから、作製したキメラ受容体がFlを認識して増殖シグナルを伝達しうることが示された。続いて、回文配列を持つオリゴDNAの5'末端をFlラベルしたものをアニーリングさせることによって、Fl dimerを作製した。オリゴDNAリンカー長は、EpoRのD2ドメインのN末端間距離が約35Åであることを指標に、8mer〜14mer(30〜53Å)とした。BsA-Fl選択後の細胞を用いて、これらのFl dimerを添加したところ、いずれのキメラ受容体も細胞増殖がみられ、最適なリンカー長は12〜13mer、最適濃度は約1μMであることが分かった。また、ScFv-gp130に関しては、選択前の細胞にFl dimer(12merおよび13mer)を添加して直接選択を試みたところ、Fl dimer依存的な増殖が見られ、EGFP陽性細胞率はほぼ100%となった。以上の結果から、ScFv-受容体キメラとFl dimerによる人工的情報伝達系の有効性と遺伝子導入細胞の選択的増幅法としての応用可能性が示された。今後は樹状細胞や細胞傷害性T細胞での選択的増幅の実現可能性について検証する予定である。

This study provides an indication of the role of small molecules in immunogenicity in vivo. Small molecule Fl antibody selection, anti-Fl antibody domain, self-locking antibody (ScFv) synthesis, antibody cDNA library phase-display method Epo binding receptor (EpoR) ScFv substitution of anti-Fl antibody, intracellular substitution of IL-6 receptor beta lock, gp130, IL-2R beta lock, IL-2R gamma lock, c-kit substitution of epoR receptor (ScFv-gp130,ScFv-IL-2R beta, ScFv-IL-2R gamma, ScFv-kit). Objective: To select and align the binding sites (IRES) in the downstream of the receptor. IL-3-dependent hemocyte cell line Ba/F3 cells were introduced, Fl marker BSA(BSA-Fl) was added, cultured, and cultured. The 5'end of the DNA is controlled by the sequence of DNA fragments. The distance between the D2 terminal and the N-terminal of EpoR is about 35 nm, 8mer ~ 14mer(30 ~ 53 nm). After BsA-Fl selection, the cells were cultured in medium, and the Fl dimer was added to the medium. The optimal concentration of BsA-Fl was 12 ~ 13mer. F1 dimer(12mer and 13mer) was added to the cells prior to selection. F1 dimer dependent proliferation was observed. EGFP positive cell rate was 100%. The above results show that ScFv receptor selection and Fl dimer selection are effective and feasible. In the future, the probability of increasing the selection of dendritic cells and cytotoxic T cells will be determined.

项目成果

Kawahara M., et al.: "Bypassing antibiotic selection : positive screening of genetically modified cells with an antigen-dependent proliferation switch"Nucl. Acids Res.. (in press). (2003)

Kawahara M.等人：“绕过抗生素选择：使用抗原依赖性增殖开关对转基因细胞进行阳性筛选”Nucl。

Kawahara M., et al.: "Selection of highly productive mammalian cells based on an inducible growth advantage using an antibody/receptor chimera"J. Biosci. Bioeng.. 93. 399-404 (2002)

Kawahara M. 等人：“使用抗体/受体嵌合体基于诱导生长优势选择高产哺乳动物细胞”J.

Kawahara M., et al.: "ACS Symposium Series 830 (Biological Systems Engineering)"Oxford University Press. 13 (2002)

Kawahara M.等人：“ACS Symposium Series 830（生物系统工程）”牛津大学出版社。