細胞内情報伝達分子および分子間相互作用の時空間的イメージング技術の開発

细胞内信号分子和分子间相互作用的时空成像技术的发展

• 批准号: 19021012
• 负责人: 長棟 輝行
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19021012/
• 关键词: シグナル伝達; バイオイメージング; 抗体; 受容体; FRET; スクリーニング; 細胞; エレクトロポレーション

本年度は, ノンラベルの細胞内シグナル伝達分子のリン酸化などの動的挙動を精密観測する細胞内蛍光免疫イメージング技術を実現するために、その材料となる抗体の迅速選択技術に関して検討を行った。まず、抗原としてsuperoxide dismutase(SOD)で免疫したマウスの脾臓から抗体可変領域を増幅してVL、VHおよびScFvライブラリーを調製した。これに受容体を連結したキメラ受容体ライブラリー遺伝子をIL-3依存性Ba/F3細胞に導入しIL-3を除去しSOD存在下で増殖した細胞を回収し、これらの細胞が有する抗体断片のSODへの結合性を評価した。その結果、偽陽性が多いという問題はあったが、抗原結合性抗体断片が得られたことから、本手法による抗体選択の実現可能性を示すことができた。また、抗fluorescein抗体ScFvを各種サイトカイン受容体の細胞内ドメインと連結したキメラ受容体発現Ba/F3細胞を調製してtranswell plateで鉛直方向のmigration assayを行ったところ、マクロファージコロニー刺激因子受容体(c-fms)、幹細胞因子受容体(c-kit)および上皮成長因子受容体(EGFR)と融合したキメラ受容体発現細胞が抗原濃度勾配に従って遊走することが示された。また、ScFv-EGFRキメラ受容体を発現するNIH3T3細胞を水平方向の遊走が観察できるケモタキシスチャンバーで解析した結果、細胞が抗原に向かって方向性を持って遊走していることが示唆された。以上より、細胞の遊走性を指標とした抗体選択法への応用可能性を示すことができた。

This year, we conducted research on the development of intracellular photoimmunology techniques for the precise measurement of molecular activity and the rapid selection of antibodies. Antigen and superoxide dismutase(SOD) can be modulated by increasing the amplitude of VL, VH and ScFv antibodies. IL-3-dependent Ba/F3 cells were introduced into the receptor system, and IL-3-dependent Ba/F3 cells were cultured in the presence of SOD. As a result, there are many false positives and antigen-binding antibody fragments are available, which shows the possibility of antibody selection in this method. Anti-fluorescein antibody ScFv is used to modulate Ba/F3 cells in the migration assay in the vertical direction. Stem cell factor receptor (c-kit) and epidermal growth factor receptor (EGFR) fusion and receptor production cells are shown to be antigen concentration matched. NIH 3T3 cells were found to have horizontal migration and orientation of ScFv-EGFR receptor. The above cell mobility indicators indicate the possibility of antibody selection and use.

项目成果

Antigen-mediated migration of murine pro-B Ba/F3 cells via an antibodv/receptor chimera

通过抗体/受体嵌合体抗原介导的鼠 pro-B Ba/F3 细胞迁移

• 发表时间: 2008
• 期刊: J. Biotechnol 133
• 作者: Kawahara;M.;et.al.
• 通讯作者: et.al.

Biomolecular Engineering for Nano-Biotechllology

纳米生物技术的生物分子工程

• 发表时间: 2007
• 作者: Kawahara;M.;et.al.;河原正浩ら;Wenhai Liu;Wenhai Liu;福島一幸;Wenhai Liu;Teruyuki Nagamune;Teruyuki Nagamune
• 通讯作者: Teruyuki Nagamune

Construction of a Fluorescein-Responsive Chimeric Receptor With Strict Ligand Dependency

• DOI: 10.1002/bit.21961
• 发表时间: 2008-12-01
• 期刊: BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING
• 影响因子: 3.8
• 作者: Liu, Wenhai;Kawahara, Masahiro;Nagamune, Teruyuki
• 通讯作者: Nagamune, Teruyuki

SPATIOTEMPORAL BIOIMAGIN OF MAP KINASE PHOSPHORYLATION IN A LIVING CELL USING FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER

利用荧光共振能量转移进行活细胞中 MAP 激酶磷酸化的时空生物成像

• 发表时间: 2007
• 作者: Kawahara;M.;et.al.;河原正浩ら;Wenhai Liu;Wenhai Liu;福島一幸;Wenhai Liu;Teruyuki Nagamune
• 通讯作者: Teruyuki Nagamune

Selective expansion of genetically modified T cells using an antibodv/interleukin-2 receptor chimera

使用抗体/白细胞介素 2 受体嵌合体选择性扩增转基因 T 细胞

• 发表时间: 2008
• 期刊: J. lmmunol. Methods 337
• 作者: Sogo;T.;et.al.
• 通讯作者: et.al.