抗腫瘍活性を高めるエフェクター細胞および樹状細胞の選択的増幅法の開発

开发效应细胞和树突状细胞的选择性扩增方法以增强抗肿瘤活性

• 批准号: 13218031
• 负责人: 長棟 輝行
• 金额: $ 3.14万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218031/
• 关键词: 樹状細胞; 抗体; 受容体; 遺伝子治療; がん; 選択的増幅

1.抗体/受容体キメラを用いた遺伝子導入細胞の選択的増幅法の開発 本研究ではまず、培養細胞レベルで抗体/受容体キメラを用いた目的遺伝子導入細胞の選択的増幅法を確立することを目指した。エリスロポエチン受容体(EpoR)のリガンド結合ドメインを抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)抗体HyHEL-10の可変領域VHまたはVLに置換し、細胞内ドメインをIL-6受容体β鎖であるgp130に置換したキメラ受容体(それぞれHg、Lg)発現ベクターを作製した。さらに、目的遺伝子のモデルとして緑色蛍光タンパク質EGFPを選び、Lgの下流に内部リボソーム結合部位(IRES)配列を介して連結した(LgIGFP)。EGFP陽性細胞をHELの添加によって選択的に増幅できるかどうかを検証するために、IL-3依存性血球細胞であるBa/F3に対しレトロウイルスを用いてHgとLgIGFPの同時導入を行った。6〜7日後、IL-3を洗浄除去し、HELまたはIL-3添加培地中で選択した。選択前後におけるEGFPの発現量および陽性率をFACSによって比較した結果、選択前のEGFP陽性率は1%程度であったが、HEL添加培地中で増殖が見られ、選択後のEGFP陽性率はほぼ100%であった。それに対し、IL-3添加培地中で培養した場合は選択前の陽性率とほぼ同等であったことから、キメラ受容体由来の増殖シグナルにより遺伝子導入細胞が選択的に増幅されたと考えられる。2.遺伝子導入樹状細胞の選択的増幅 目的遺伝子とキメラ受容体を確実に同時発現させるために、Hg, LgおよびEGFPをIRESを介してタンデムに連結したレトロウィルスベクター(pMX-Hg-I-Lg-I-EGFP)を作製した。このベクターをまずBa/F3細胞に導入した結果、EGFPの発現が見られ、またHEL濃度依存的に増殖したことから、このベクターが正しく機能することが確認された。次に、マウス骨髄から樹状前駆細胞を得て、IL-6,sIL-6Rα,SCFを併用添加して培養したところ、前駆細胞を未分化状態のまま増殖維持できることが分かった。そこで、樹状前駆細胞にpMX-Hg-I-Lg-I-EGFPをレトロウイルスにより導入したところ、導入効率は1.1%と低かったものの導入できることが分かった。現在、遺伝子導入樹状前駆細胞をHELとSCFを併用添加した培地中で選択しており、経時的にEGFP陽性細胞率をFACSで測定し、本手法を用いた選択的増幅の実現可能性について検証中である。

1. Development of Amplitude Enhancement Method for Selection of Antibody/Receptor Vector into Cells in Vitro and Cultured Cells EpoR (EpoR) is a novel receptor (EpoR). The variable domain VH of antibody HyHEL-10 can be replaced by VL, and the intracellular EpoR (EpoR) can be replaced by IL-6 receptor (EpoR). In addition, the target gene is selected from the green fluorescent protein, and the downstream internal fluorescent binding site (IRES) is arranged in the LgIGFP. EGFP-positive cells were added to HEL cells, and IL-3-dependent cells were added to HEL cells. 6 ~ 7 days later, IL-3 was removed by washing, and HEL was added to the culture medium. The EGFP positive rate before and after selection was 1% and the EGFP positive rate after selection was 100%. Therefore, when IL-3 is added to the culture medium, the positive rate before selection is the same as that before selection. However, due to the proliferation mechanism of the origin of the receptor, the introduction of the gene into the cells increases the selection rate. 2. The gene was introduced into dendritic cells and the selected target gene was successfully developed simultaneously with the expression of Hg-Lg-EGFP (pMX-Hg-I-Lg-I-EGFP). The expression of EGFP in Ba/F3 cells was confirmed as a result of the introduction of EGFP into Ba/F3 cells, and the expression of EGFP in Ba/F3 cells was confirmed as a result of HEL concentration-dependent proliferation. The cells were cultured with IL-6,sIL-6R α and SCF and maintained in an undifferentiated state. pMX-Hg-I-Lg-I-EGFP is introduced into the tree-like cells at a rate of 1.1%. Now, the gene is introduced into the dendritic cells, HEL and SCF are added to the culture medium, EGFP positive cell rate is measured by FACS, and the possibility of increasing the amplitude of selection by this method is detected.

项目成果

Kawahara, M. et al.: "A growth signal with an artificially induce erythropoietin receptor-gp130 cytoplasmic domain heterodimer"J. Biochem.. 130. 305-312 (2001)

Kawahara, M. 等人：“人工诱导促红细胞生成素受体 -gp130 胞质结构域异二聚体的生长信号”J.

Kawahara, M. et al.: "Animal cell technology for creation of new era (JAACT 2000)"Kluwer Academic Publishers (in press).

Kawahara, M. 等人：“创造新时代的动物细胞技术 (JAACT 2000)”Kluwer 学术出版社（正在印刷中）。

Kawahara, M., et al.: "Selection of highly productive mammalian cells based on an inducible growth advantage using an antibody/receptor chimera"J. Biosci. Bioeng. 93(in press). (2002)

Kawahara, M., et al.：“使用抗体/受体嵌合体基于诱导生长优势选择高产哺乳动物细胞”J.

河原正浩: "無血清・低血清培地で増殖する動物細胞の創出"バイオサイエンスとインダストリー. 59. 617-618 (2001)

Masahiro Kawahara：“在无血清和低血清培养基中生长的动物细胞的创建”《生物科学与工业》59. 617-618 (2001)。

Kawahara, M., et al.: "Advances in Biochemical Production Technologies"Oxford University Press(in press).

Kawahara, M., et al.：“生化生产技术的进展”牛​​津大学出版社（正在出版）。