核内に存在する成熟体tRNAの生理的意義の解析

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本計画では、核内の成熟体プールがどのように形成され、どのような生理的意義を持つかを明らかにする目的で、酵母を材料として以下の解析を行った。◆RNA polymerase IIIのts変異を用い、転写停止後の前駆体tRNAおよび成熟体tRNAの細胞内動態をFISH法で解析した。その結果、予想通り核内の前駆体tRNAは制限温度下で速やかに減少した。一方、核領域に検出される成熟体tRNAは、低いレベルにあるものの、さらに減少する傾向は示さなかった。これは、成熟体tRNAの量が必ずしも、転写量とカップルしていない可能性を示唆している。現在、さらに定量的な解析を共焦点顕微鏡システムで行っている。◆^3H-uracilを用いたpulse-chase・hybrid-precipitation実験を行い、個々のtRNA分子種の動態を解析した。温度感受性splicing欠損株において、制限温度下で蓄積した前駆体tRNAが、許容温度にシフトすることで成熟体にチェイスされることが明らかとなった。我々は、既に、この変異株が制限温度下で前駆体tRNAを細胞質に蓄積することと言う結果を得ており、これとあわせると上記の結果は、細胞質でtRNAのsplicingが起こることを示す有力な証拠である。◆tRNA核外輸送因子Los1pと機能的に拮抗する因子を検索するため、過剰生産時にlos1欠失変異が致死となる遺伝子を酵母多コピーライブラリーよりスクリーニングした。現在、3種類の候補クローンを得ており、含まれるORFのうちどれが現遺伝子であるかの特定を行っている。これらの遺伝子は、成熟体tRNAを細胞質から核へ供給する因子である可能性を持っており、過剰生産時のtRNAの挙動を含め、解析を進めてゆく。