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HSP90-Cdc37シャペロンによる情報伝達キナーゼのクオリティーコントロール

HSP90-Cdc37 伴侣对信号转导激酶的质量控制

基本信息

批准号：
14037234
负责人：
宮田愛彦
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037234/
关键词：
HSP90 Cdc37 Kinase MOK 分子シャペロン X線結晶解析タンパク質分解立体構造

项目摘要

平成13年度までの研究でMAPキナーゼスーパーフアミリーに属する新しいSer/ThrキナーゼMOKを同定し、マウス及びヒトの完全長cDNAをクローニングした。MOKと細胞内で相互作用するタンパク質を検索した結果、HSP90及びCdc37を含む一群の分子シャペロンがMOKと結合することを見いだした。また、HSP90の特異的阻害剤であるゲルダナマイシンで細胞を処理することによってMOKがプロテアソーム依存性に速やかに分解されることから、HSP90-Cdc37分子シャペロンがMOKキナーゼの細胞内安定性に必須であることも判った。この分解にCHIPが関与するかどうかを調べたが、CHIPはMOK-シャペロン複合体には含まれていなかった。分子シャペロンの作用機構の詳細を知るためにはその立体構造の解明が必要である。HSP90に関しては既に幾つかのドメインについて分子構造が明らかにされている。今回、Cdc37の立体構造を明らかにする目的でそのX線結晶解析を試みている。Cdc37に関してはドメイン構造が明らかではないため、全長のCdc37に加えてC末端欠失変異体を4種、N末端欠失変異体を3種類、及び想定されるリン酸化部位の変異体2種類をコードする発現プラスミドを構築し、いずれもGST-tagのついたリコンビナントタンパク質を大腸菌に発現させ、glutathioneビーズを用いて精製した。さらにGST-tag部分をPrescission proteaseで切断・除去し、最終的にResourseQ陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。上記のうち全長Cdc37を含めて計8種類のCdc37変異体がいずれもほぼ均一で予想される分子量を持つタンパク質として充分量精製された。現在これらのリコンビナントタンパク質を用いて各種条件下において結晶化のコンディションを探索中である。

2013 までの Research でMAP キナーゼスーパーフアミリーに gens する新しいSer/ Thr キナーゼMOK を同定し, マウス and びヒトのfull-length cDNA をクローニングした. MOK and intracellular interactions, HSP90 and C dc37 contains a group of molecules, シャペロンがMOK, and combines them with each other.また、HSP90's specific inhibitory agent Cellular Processing System Dependency System The decomposition of HSP90-Cdc37 molecules and the stability of the intracellular stability of HSP90-Cdc37 molecules are necessary. CHIP's decomposition and CHIP's separation, CHIP's MOK-シャペロン complex's CHIP and CHIP's structure. It is necessary to understand the three-dimensional structure of the molecular structure in detail. HSP90 is a molecular structure of HSP90. This time, we will try to analyze the three-dimensional structure of Cdc37 using X-ray crystallography. Cdc37に关してはドメインstructuralが明らかではないため、Full lengthのCdc37に加えてC There are 4 types of terminal missing variants, 3 types of N-terminal missing variants, and N-terminal missing variants of the acidified site. 2 types of をコードする発成プラスミドをconstructedし、いずれもGST-tagのついたリコンビThe quality of ナントタンパク性を coliform is present and the glutathione is refined with いて.さらにGST-tag part をPrescission proteaseでcut・removeし、Final にResourseQ Yinイオン Exchange クロマトグラフィーによってRefined した.上记のうちFull length Cdc37をcontainingめて total 8 typesのCdc37変variantがいずれThe molecular weight of the もほぼ is uniform and the される molecular weight is maintained and the つタンパク quality is the sufficient amount of refined された. Now we are exploring the use of crystallized crystallized crystals under various conditions.