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熱ショック蛋白質HSP90のSV40ラージT抗原との複合体形成の解析

热休克蛋白HSP90与SV40大T抗原复合物形成分析

基本信息

批准号：
05858105
负责人：
宮田愛彦
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

SV40のLargeT抗原(LT)は、ダブルヘキサマーの多機能酵素である。またLTはHSP70と複合体を形成することから、その高次構造形成にはシャペロン蛋白質の関与が考えられる。そこで、HSP90が細胞内でLTと複合体を形成してLTの局在・高次構造形成・活性等を制御する可能性を考え、以下の実験結果を得た。LTとHSP90とのSDS-PAGE上の分子量はほぼ同一であった。そこで、SV40でトランスフォームした細胞株とそれぞれの親細胞株の粗抽出液から、LTとHSP90を免疫沈降し、免疫複合体に含まれる蛋白質をWestern blottingによって解析した。その結果、COSなどのLT発現細胞でHSP90を免疫沈降するとLTが、またLTを免疫沈降するとHSP90が、共沈降されることがわかった。この共沈降は、LTを発現していないCV1、HeLa細胞では観察されなかった。p53とHSP90とも共沈降は観察されず、また予めP53をimmuno-depleteした細胞粗抽出液でもHSP90とLTとの共免疫沈降が観察された。このことから、HSP90とLTの複合体形成にはp53は無関係であると結論された。HSP90はHSP70やカゼインキナーゼII(CKII)とも複合体を形成している。一方 LTもp53もHSP70と複合体を形成し、またLTはCKIIの基質でありp53とCKIIは共免疫沈降することが知られている。おそらく細胞内でこれらの多数の蛋白質が様々な組み合わせで複合体を形成していると考えられる。HSP90のシャペロン様機能を調べるため、HSP90とLTとを精製し、in vitroの再構成の実験を試みた。LTは、温度・ATP依存的にmonomerから6-merを形成した。比較的低温ではHSP90の存在下でATP依存性のLTの6-mer形成が促進された。これらの結果は、細胞内でLTは合成後一過的にHSP90と相互作用して活性型の6-mer形成をしている可能性を示唆している。LTのDNA結合能に対してはHSP90を単にin vitroで加えただけでは影響が見られなかった。

SV40 LargeT antigen (LT) HSP70 complex formation, the formation of higher-order structures, the relationship between protein and protein The possibility of controlling the formation of LT complex in cells of HSP90 and HSP90 was investigated. The following results were obtained The molecular weight of HSP90 on SDS-PAGE is the same as that of HSP90. Western blotting analysis of proteins in the immune complexes of SV40 and HSP90 The results showed that COS and LT developed HSP90 immuno-sedimentation, LT immuno-sedimentation and co-sedimentation. The results showed that CV1 and HeLa cells were detected by PCR. p53 and HSP90 co-precipitation were detected, and P53 was immuno-depleted. HSP90 and LT complex formation are not related to p53. HSP90 and HSP70 form a complex called CKII. A LT p53-HSP70 complex is formed, and a LT p53-CKII matrix is formed. Most of the proteins in the cell are assembled into complexes. HSP90 and LT are refined and reconstructed in vitro. Temperature and ATP dependent monomer formation Compared with low temperature, the ATP dependence and LT 6-mer formation were promoted in the presence of HSP90. The results indicate the possibility of HSP90 interaction and 6-mer formation after LT synthesis in cells. LT DNA binding can be detected by HSP90 in vitro.