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核移行シグナルペプチドによって活性化されるGRP94キナーゼの同定と解析

核定位信号肽激活的GRP94激酶的鉴定与分析

基本信息

批准号：
07780642
负责人：
宮田愛彦
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780642/
关键词：
カゼインキナーゼII 核移行シグナルストレス蛋白質 CK2 GRP94 HSP リン酸化ペプチド

项目摘要

蛋白質の核移行は特定のアミノ酸配列が核移行シグナルとして認識されて起こる。また、核移行がリン酸化によって制御される例が転写因子等で報告され、リン酸化と蛋白質の細胞内局在の興味深い関係が示唆される。SV40ラージT抗原の核移行シグナル(PKKKRKVEDP)に相当するペプチド(以下NLS)を合成し、培養細胞の粗抽出液に加えて内在性のキナーゼによる蛋白質のリン酸化をNLSの有無で比較した。分子量約100k,80k,50k,45k等の複数の蛋白質のリン酸化がNLSによって顕著に促進された。細胞内での蛋白質の局在の制御には分子シャペロン(ストレス蛋白質)が深く関与することから、NLSによってリン酸化の亢進する蛋白質と分子シャペロンとの関係を調べた。その結果、分子量約100kの蛋白質はGRP94の抗体によって免疫沈降され、GRP94であることが示された。従って、NLSによって活性が促進され、GRP94を基質とする内在性のキナーゼが存在することが示唆された。そこで、GRP94をキナーゼフリーにまで精製し、NLS存在下に精製GRP94をリン酸化する活性を指標としてL5178Y細胞の抽出液からResourceQ(陰イオン交換カラム),POROS-Heparin, Hydroxylapatite, MonoQの各カラムクロマトグラフィーによって目的のキナーゼを精製した。但し、精製の終段階でこのキナーゼはNLSに依存せずにGRP94をリン酸化するようになった。精製されたキナーゼは銀染色で分子量約43kと27kの2本のバンドからなり、この分子量はカゼインキナーゼII(CKII)のそれと一致した。改めて各カラムクロマトグラフィー上でのCKII活性を特異的な基質ペプチドを用いたアッセイによって追跡すると、両キナーゼの各カラムクロマトグラフィー上での挙動はほぼ一致した。また、別にブタの精巣から完全精製したCKIIはGRP94をNLSに依存せずに良くリン酸化した。更に、部分精製したNLS依存性のキナーゼによるGRP94のリン酸化部位と、精製したCKIIによるGRP94のリン酸化部位は、V8によるペプチドマップでは同じであった。以上のことから、細胞の粗抽出液中ではCKIIがNLS依存的にGRP94をリン酸化していること、またこのNLS依存性はCKIIそのものの性質ではなく、NLSは細胞粗抽出液に存在して精製CKIIには含まれない何らかの抑制性の制御因子を介してGRP94に対するCKIIの活性を制御していることが判った。現在この因子の同定と精製を進めている。

The nuclear migration of proteins is not specific to the sequence of amino acids. In addition, the expression of transcription factors in the regulation of nuclear migration and the intracellular regulation of transcription proteins are also reported. SV40-T antigen nuclear migration pathway (PKKKRKVEDP) is the equivalent of protein synthesis (NLS), and the presence or absence of protein acidification in crude extracts of cultured cells is also discussed. A number of proteins with molecular weights of about 100k,80k,50k,45k, etc. were acidified and promoted by NLS. The regulation of protein in cells is related to the regulation of protein and molecular structure. As a result, the protein with molecular weight of about 100k was detected by immunoprecipitation. NLS activity is promoted, GRP94 activity is promoted, and GRP activity is promoted. Refined GRP 94 in the presence of NLS, purified GRP94 in the presence of NLS. However, the final stage of refinement depends on the GRP94. The molecular weight is about 43k and 27k, and the molecular weight is about 27k and 27 k. The CKII activity on each substrate was changed to be consistent with the activity on each substrate. The CKII is GRP94 and NLS is dependent on the quality of the product. In addition, the NLS dependence of the partial refining is not limited to the acidification site of the GRP94, but rather to the V8 site. The above results indicate that CKII is an NLS-dependent inhibitor of GRP94 in crude extracts of cells, and that NLS is an NLS-dependent inhibitor of CKII activity in crude extracts of cells. Now, the factors are constant and refined.