熱ショック蛋白質HSP90とFK506結合蛋白質FKBP52との複合体の解析

热休克蛋白HSP90与FK506结合蛋白FKBP52复合物分析

基本信息

批准号：
06780600
负责人：
宮田愛彦
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780600/
关键词：
熱ショック蛋白質 HSP HSP90 FK506 FKBP 免疫抑制剤分子シャペロン

项目摘要

免疫抑制剤FK506の細胞内結合蛋白質のうち、高分子量のFKBP52は熱ショック蛋白質HSP90と複合体を形成している。本研究ではHSP90とFKBP52との複合体形成の生理的意義を明らかにすることを目的として以下の実験を行った。まずFK506の32位の-OH基を保護基を入れたアミノ酸を用いてエステル化し、パラジウム触媒下に保護基を外して生じたアミノ基を介してAffiGel-10にカップリングしてFK506アフィニティー樹脂を作成した。放射性メチオニンでラベルした細胞の粗抽出液中からFK506アフィニティー樹脂に結合する複数のFKBPを単離した。一方で報告されたヒトFKBP52のアミノ酸配列から、そのC末端に相当するペプチドを化学合成し、同ペプチドに対するウサギ抗体を作成した。この抗体は上記FK506アフィニティー樹脂を用いて精製したFKBP52を特異的に認識した。この抗体を用いてFKBP52の2次元等電点電気泳動上のpIを5.4と決定した。また、in vitroでのpeptidyl-prolyl-isomerase(PPIase)活性の測定系を確立した。基質としてはプロリン残基を含むキモトリプシン基質標識ペプチドを用いた。このペプチドはプロリン残基での異性化に伴ってキモトリプシンの基質となって切断され発色する。切断前後の吸収差スペクトルから385nmの吸収を測定することでPPIase活性を高感度に測定することができると考えられた。実際細胞粗抽出液を用いて同活性をこの系で測定することができたが、PPIaseに依存しない異性化の速度が無視できないことが判り、より低い温度での測定系を開発した。但しFK506アフィニティー樹脂で精製したFKBPのPPIase活性は、溶出に用いた過剰量のFK506の為にPPIase活性が阻害されていて検出できなかった。HSP90と複合体を形成する事を既に明らかにしているSV40ラージT抗原を取りあげ、ラージT抗原とFKBP52とが細胞粗抽出液中で複合体を形成しているかどうかを調べた。しかし、共免疫沈降実験では相互の複合体形成は観察されなかった。一方カゼインキナーゼIIもHSP90と複合体を形成する事から、カゼインキナーゼIIとFKBP52とが相互作用する可能性が考えられる。実際、FKBP52は精製カゼインキナーゼIIの基質としてリン酸化されることが明らかとなった。

在免疫抑制剂FK506的细胞内结合蛋白中，高分子量FKBP52与热休克蛋白HSP90形成复合物。在这项研究中，进行了以下实验，以阐明HSP90和FKBP52之间复合物形成的生理意义。首先，使用含有保护组的氨基酸对FK506位置的-OH组进行酯酯化，然后通过通过在钯催化剂下删除保护组来制备FK506亲和力树脂，然后通过除去保护组而产生的氨基组与Affigel-10耦合。从放射性蛋氨酸标记的细胞的粗提取物中分离出与FK506亲和力树脂结合的多个FKBP。另一方面，从报道的人FKBP52的氨基酸序列中化学合成了与C末端的肽，制备了与肽的兔抗体。该抗体专门识别使用上述FK506亲和力树脂纯化的FKBP52。使用该抗体，确定FKBP52的2D等电聚焦PI为5.4。此外，还建立了用于测量肽基培养基 - 异构酶（PPIASE）活性的系统。作为底物，使用了含有含有脯氨酸残基的肽的胰凝乳蛋白酶底物。该肽变成甲侧丙二酰丙二酰蛋白酶的底物，并在脯氨酸残基处异构化时会形成颜色。据认为，可以通过在切割前后的吸收差异下和在385 nm处测量385 nm的吸收来测量PPIASE活性。实际上，可以使用该系统使用粗细胞提取物来测量相同的活性，但是发现与PPIASE无关的异构化速率不能忽略，并且在较低温度下开发了测量系统。然而，由于使用过量的FK506用于洗脱，因此无法检测到用FK506亲和力树脂纯化的FKBP的PPIASE活性。我们采用了SV40大T抗原，该抗原已经显示出与HSP90形成复合物，并检查了大T抗原和FKBP52是否在粗细细胞提取物中形成复合物。但是，在共免疫沉淀实验中未观察到相互络合物的形成。另一方面，由于酪蛋白激酶II还与HSP90形成复合物，因此酪蛋白激酶II和FKBP52可能相互作用。实际上，已经揭示了FKBP52被磷酸化为纯化的酪蛋白激酶II的底物。