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N-末へのペプチド融合による蛋白質の耐熱性増大法の研究

N端肽融合提高蛋白质热稳定性的方法研究

基本信息

批准号：
08876014
负责人：
星野貴行
金额：
$ 1.34万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08876014/
关键词：
高度好熱性細菌 Thermus thermophilus 蛋白質の耐熱性

项目摘要

現在遺伝子組換えを含むgenetic manipulationが行える生物のうちで最も高温で生育できるThermus thermophilusの宿主・ベクター系には、選択マーカーとして使用できる唯一の抗生物質耐性遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子の発現上限温度が、宿主の至適生育温度より10℃も低い60℃であるという問題点があった。このカナマイシン耐性遺伝子をレポーターとして70℃でもカナマイシン耐性を発現できるクローンを選択したところ、カナマイシン耐性遺伝子の上流に、未知のopen reading frame (ORF)が融合した形のクローンが得られていた。つまり、カナマイシン耐性遺伝子産物(カナマイシン不活化(修飾)酵素)のN-末に61個のペプチドが融合したために、カナマイシン修飾酵素の発現上限温度が上昇したと考えられていた。上記の仮説を証明するために、融合型カナマイシン修飾酵素のT.thermophilusからの精製を試みたが、発現量が少ないために成功しなかった。そこで、大腸菌で融合型酵素の大量発現を図ったが、融合型遺伝子は大腸菌発現ベクター中にクローンすることさえ不可能であった。そこで、融合遺伝子にフレームシフト変異を人為的に導入し、T.thermophilus内での発現上限温度を検討したところ、非融合型と同じ60℃にまで低下していた。また、融合していたORFの全長を改めてT.thermophilusゲノムからクローニングしたところ、当該ORFはT.thermophilusのリボゾーム蛋白L32をコードするものであることが明らかとなった。以上の結果から、リボゾーム蛋白L32のN-末領域がカナマイシン修飾酵素のN-末に融合した結果、融合型カナマイシン修飾酵素の生体内での熱安定性が上昇したことが確認された。

Now the genetic manipulation of the genetic subgroup is changing, including the genetic manipulation of the living things. It is the hottest temperature for reproduction. The host of Thermus thermophilus is the only antibiotic resistant gene. It is the only antibiotic resistant gene that can be used selectively. The upper limit temperature for the development of the resistant gene and the optimal reproductive temperature of the host are 10℃ and The open reading frame (ORF) of the resistance gene is selected from the open reading frame (ORF) of the resistance gene upstream and unknown at 70℃. The upper limit temperature of expression of 61 N-terminal genes of resistant gene products (inactivated (modified) enzymes) was increased. The results of this study demonstrate that T.thermophilus, a fusogenic enzyme, has been successfully purified. Therefore, it is impossible for a large number of fusion enzymes to be discovered in Escherichia coli, and for fusion enzymes to be discovered in Escherichia coli. The upper limit temperature of occurrence in T.thermophilus is lower than that in T.thermophilus When the ORF T.thermophilus is fused, the length of the ORF is changed. When the ORF T.thermophilus is fused, the length of the ORF is changed. As a result, the thermal stability of the fusion protein L32 in vivo increased.