HIV感染機構の解明:ケモカイン受容体・リガンド相互作用の構造生物学的研究

阐明HIV感染机制：趋化因子受体-配体相互作用的结构生物学研究

基本信息

批准号：
16017223
负责人：
寺沢宏明
金额：
$ 6.91万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16017223/
关键词：
転移交差飽和法ケモカインケモカイン受容体 RANTES CCR5 GPCR HIV Budded virus

项目摘要

GPCRなどの膜蛋白質とリガンドとの相互作用を原子レベルで解析するためには、相互作用解析のための適切な手法の確立と、活性を保持した標的膜蛋白質の大量発現系の構築が必要である。我々は、巨大分子上の受容体に対するリガンド分子の結合部位を同定出来る新規NMR手法である、転移交差飽和法を開発した。また近年、昆虫細胞発現系において発芽するリコンビナントバキュロウイルス(budded virus : BV)上に、活性を保持したリコンビナント膜蛋白質が発現していることが報告されている。我々はCCR5発現BV(CCR5-BV)を用いた転移交差飽和実験を行うことにより、RANTES上のCCR5に対する結合部位を同定した。また、本手法が適用可能なリガンド:受容体比の範囲を明らかにするため、CCR5-BV上に発現したCCR5の定量を行なった。さらに、RANTESとCCR5との相互作用に関する速度論的解析を行った。これらにより、本手法の論理的基盤を確立した。我々が同定したRANTES上のCCR5結合部位が、CCR5の活性化にどのような役割を果たしているかについては不明であった。そこで、本研究で明らかになった結合部位を介する相互作用の役割を調べるため、同定した結合部位、シグナル伝達に重要と考えられているN末端、その他の領域それぞれに変異を導入し、ケモタキシスアッセイを行った。その結果、同定した結合部位に変異を導入すると、受容体との親和性は低下するが、シグナル伝達活性は保持されること、一方、N末端領域への変異導入は、シグナル伝達活性を大きく低下させることがわかった。以上、本研究により、リガンド上の膜蛋白質結合部位を決定する手法を開発した。得られた知見は、抗HIV薬の開発やケモカイン-ケモカイン受容体相互作用の理解に大きく貢献するものであると考える。

为了分析原子水平上的配体（例如GPCR）之间的相互作用，有必要建立一种适当的相互作用分析方法，并构建一个用于表达大量活性靶向靶膜蛋白的系统。我们已经开发了一种新型的NMR技术，一种易位交叉饱和方法，可以鉴定配体分子与大分子上受体的结合位点。近年来，据报道，重组膜蛋白保留活性是在昆虫细胞表达系统中发芽的芽病毒（BV）表达的。我们通过使用表达CCR5的BV（CCR5-BV）进行易位交叉饱和实验来确定CCR5的结合位点。此外，为了阐明可以应用该方法的配体：受体比率的范围，我们量化了在CCR5-BV上表达的CCR5。另外，对rantes与CCR5之间的相互作用进行了动力学分析。这些已经为此方法建立了逻辑基础。目前尚不清楚我们在CCR5激活中发现的CCR5结合位点的作用。因此，为了通过本研究中揭示的结合位点研究相互作用的作用，在确定的结合位点引入了突变，N端被认为对信号传导和其他区域和趋化性测定都很重要。结果，发现将突变引入确定的结合位点会降低与受体的亲和力，但保留信号活性，同时将突变引入N末端区域可显着降低信号传导活性。这项研究开发了一种确定配体上膜蛋白结合位点的方法。所获得的发现对抗HIV药物的发展以及对趋化因子化学化学受体相互作用的理解产生了显着贡献。

项目成果

期刊论文数量（10）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

^1H,^<13>C,^<15>N backbone resonance assignments of the hyaluronan-binding domain of CD44.

CD44的乙酰透明质酸结合结构域的^ 1 H、^ 13 C、^ 15 N主链共振分配。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
J.Biomol.NMR 29
影响因子：
0
作者：
Gotoh;B.;Nishitsuji H. et al.;Takeda Mitsuhiro et al.
通讯作者：
Takeda Mitsuhiro et al.

An NMR method for the determination of protein-binding interfaces using dioxygen-induced spin-lattice relaxation enhancement.

一种使用分子氧诱导的自旋晶格弛豫增强来确定蛋白质结合界面的 NMR 方法。

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
J.Biol.Chem. 280・43
影响因子：
0
作者：
Aravin;A.(7名);Kuramochi-Miyagawa;S.;Nakano;T.(6);Tuschl,T;Addy C.;Takeuchi K.;Yokogawa M;Nakasako M;Ueda T
通讯作者：
Ueda T