NMRによる原子レベルでの分子間相互作用スクリーニング法の開発

使用NMR开发原子水平的分子间相互作用筛选方法

基本信息

批准号：
14657569
负责人：
寺沢宏明
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657569/
关键词：
転移交差飽和法 CERT NMR 相互作用解析 PtdIns4P セラミド PHドメインリポソーム交差飽和法 CD44 ヒアルロン酸コンドロイチン硫酸立体構造変化 FB IgG コラーゲン vWA-A3

项目摘要

脂質分子の生合成および細胞内輸送は、生体膜の形成と細胞機能の維持に不可欠である。リガンド脂質を輸送するタンパク質が、脂質二重膜と相互作用し機能する様子を解析する方法の開発は重要である。近年、小胞体からゴルジ体へのセラミド分子の輸送を直接担う分子であるCERTが同定された。CERTはN末端にphosphatidyl-4-monophosphate (PtdIns4P)を認識するPHドメインを、C末端にceramideを認識するSTARTドメインをそれぞれ有する分子量約70kDaの細胞質タンパク質である。PHドメインが、ゴルジ膜上のPtdIns4Pを認識することにより、小胞体-ゴルジ間特異的ceramide輸送経路を獲得しているものと考えられる。NMRによる構造生物学的解析を行うため、^<15>N標識したPHドメインを調製して^1H-^<15>N HSQCスペクトルの測定を行い、アミノ酸残基数(117残基)と同数のピークを検出できるNMR測定条件を確立することに成功した。次に、PHドメイン上におけるリガンドとの相互作用に関与するアミノ酸残基を明らかにするため、PtdIns4Pを組み込んだリポソームをリガンドとしてNMR滴定実験を行った。その結果、PtdIns4P認識ドメインはPtdIns4Pのリン酸基部分近傍および脂質膜分子表面を認識している可能性が示唆された。PHドメインにおけるPtdIns4P含有リポソーム結合界面を同定するため、当研究室で開発された転移交差飽和法を適用した。その結果、PHドメインは、PtdIns4Pの頭部だけでなく、脂質膜をループ領域で認識することがわかった。本研究は、細胞膜における生体分子の相互作用を観測する手法を提示するものであり、脂質認識タンパク質のみならず、細胞膜において機能する分子の研究に広く適用可能である。

脂质分子的生物合成和细胞内转运对于形成生物膜和维持细胞功能至关重要。分析配体脂质转运蛋白如何与脂质双层膜相互作用和功能的方法的开发很重要。最近，已经鉴定出了直接进行神经酰胺分子从内质网向高尔基体运输的分子。 CERT是一种细胞质蛋白，其分子量约为70 kDa，每个蛋白具有pH结构域，在其N末端识别磷脂酰磷酸4-单磷酸（PTDINS4P），并且在其C-末端识别ceramide的起始结构域。据信，pH结构域通过识别高尔基膜上的ptdins4p在内质网和高尔基体之间获得特定的神经酰胺传输途径。为了通过NMR进行结构生物学分析，我们准备了标记为pH结构域的A ^<15> N，并测量了 ^1H - ^<15> N HSQC谱，并成功建立了NMR测量条件，允许检测到与氨基酸残基数量相同数量的峰值（117个残基）。接下来，为了阐明与配体相互作用的氨基酸残基，使用将PTDINS4P作为配体的脂质体进行了NMR滴定实验。结果表明，PTDINS4P识别结构域可以识别Ptdins4p磷酸组部分和脂质膜分子表面的附近。为了识别pH结构域中含PTDINS4P的脂质体结合界面，应用了我们实验室中开发的易位交叉饱和方法。结果，发现pH结构域不仅识别PTDINS4P的头部，而且识别环路区域中的脂质膜。这项研究提出了一种观察细胞膜生物分子相互作用的方法，并且广泛适用于研究不仅在脂质识别蛋白中功能功能的分子研究，而且还适用于细胞膜。