NMRによる原子レベルでの分子間相互作用スクリーニング法の開発

使用NMR开发原子水平的分子间相互作用筛选方法

• 批准号: 14657569
• 负责人: 寺沢 宏明
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657569/
• 关键词: 転移交差飽和法; CERT; NMR; 相互作用解析; PtdIns4P; セラミド; PHドメイン; リポソーム; 交差飽和法; CD44; ヒアルロン酸; コンドロイチン硫酸; 立体構造変化; FB; IgG; コラーゲン; vWA-A3

脂質分子の生合成および細胞内輸送は、生体膜の形成と細胞機能の維持に不可欠である。リガンド脂質を輸送するタンパク質が、脂質二重膜と相互作用し機能する様子を解析する方法の開発は重要である。近年、小胞体からゴルジ体へのセラミド分子の輸送を直接担う分子であるCERTが同定された。CERTはN末端にphosphatidyl-4-monophosphate (PtdIns4P)を認識するPHドメインを、C末端にceramideを認識するSTARTドメインをそれぞれ有する分子量約70kDaの細胞質タンパク質である。PHドメインが、ゴルジ膜上のPtdIns4Pを認識することにより、小胞体-ゴルジ間特異的ceramide輸送経路を獲得しているものと考えられる。NMRによる構造生物学的解析を行うため、^<15>N標識したPHドメインを調製して^1H-^<15>N HSQCスペクトルの測定を行い、アミノ酸残基数(117残基)と同数のピークを検出できるNMR測定条件を確立することに成功した。次に、PHドメイン上におけるリガンドとの相互作用に関与するアミノ酸残基を明らかにするため、PtdIns4Pを組み込んだリポソームをリガンドとしてNMR滴定実験を行った。その結果、PtdIns4P認識ドメインはPtdIns4Pのリン酸基部分近傍および脂質膜分子表面を認識している可能性が示唆された。PHドメインにおけるPtdIns4P含有リポソーム結合界面を同定するため、当研究室で開発された転移交差飽和法を適用した。その結果、PHドメインは、PtdIns4Pの頭部だけでなく、脂質膜をループ領域で認識することがわかった。本研究は、細胞膜における生体分子の相互作用を観測する手法を提示するものであり、脂質認識タンパク質のみならず、細胞膜において機能する分子の研究に広く適用可能である。

It is indispensable for the synthesis and intracellular transport of lipid molecules, the formation of biological membranes, and the maintenance of cell functions. Lipid transport quality, lipid double membrane interaction and function analysis method are important. In recent years, the small cell body and the molecular transport system have been directly responsible for the molecular transport of the CERT system. CERT's N-terminal phosphatidyl-4-monophosphate (PtdIns4P) するPHドメインを、C-terminal ceramide するSTART ドメインをそれぞれ has a cytoplasmic する molecular weight of about 70kDa. PH ドメインが, ゴルジ on the membrane のPtdIns4P を recognize することにより, small cell body -ゴルジ's specific ceramide delivery system is obtained by しているものと卡えられる. NMR Analysis of Structural Biology HSQC スペクトルのdetermination of を行い, アミノ acid residue number (117 residues) and the same number of のピークを検出できるNMR measurement conditions were successfully established. Secondary, PH ドメイン上におけるリガンドとのinteraction and するアミノacid residue を明らかにするため、PtdIns4Pを集团み込んだリポソームをリガンドとしてNMR titration実験を行った.そのResults, PtdIns4P recognition ドメインは PtdIns4P のリン acid group part is close to the および lipid membrane molecule surface を recognition している possibility がshows soso された. PHドメインにおけるPtdIns4P contains the リポソームcombination interface を同定するため, and the laboratory has opened the 発された転handover application of the differential saturation method.そのRESULTS, PHドメインは, PtdIns4Pの头だけでなく, Lipid membrane をループ domain でKnowledge することがわかった. In this study, the interaction of biological molecules in cell membranes and lipids are measured using techniques and tips. It is possible to understand the quality of the material and the function of the cell membrane and to study the molecules.

项目成果

^1H,^<13>C,^<15>N backbone resonance assignments of the hyaluronan-binding domain of CD44.

CD44的乙酰透明质酸结合结构域的^ 1 H、^ 13 C、^ 15 N主链共振分配。

• 发表时间: 2004
• 期刊: J.Biomol.NMR 29
• 作者: Gotoh;B.;Nishitsuji H. et al.;Takeda Mitsuhiro et al.
• 通讯作者: Takeda Mitsuhiro et al.

Noritaka Nishida: "Backbone ^1H, ^<13>C, ^<15>N, resonance assignments of the von Willebrand factor A3 domain"J.Biomol.NMR. 24. 357-358 (2002)

Noritaka Nishida：“骨干^ 1H、^ 13 C、^ 15 N，von Willebrand因子A3结构域的共振分配”J.Biomol.NMR。

Takeda Mitsuhiro et al.: "Hyaluronan recognition mode of CD44 revealed by cross-saturation and chemical shift perturbation experiments."J.Biol.Chem.. 278. 43550-43555 (2003)

Takeda Mitsuhiro 等人：“通过交叉饱和和化学位移微扰实验揭示了 CD44 的透明质酸识别模式。”J.Biol.Chem.. 278. 43550-43555 (2003)

NMR Study of Repair Mechanism of DNA Photolyase by FAD-Induced Paramagnetic Relaxation Enhancement

FAD诱导顺磁弛豫增强DNA光解酶修复机制的NMR研究

• 发表时间: 2004
• 期刊: J.Biol.Chem. 279
• 作者: Sakai;T.;Tochio;H.;Inomata;K.;Sasaki;Y.;Tenno;T.;Tanaka;T.;Kokubo;T.;Hiroaki;H.;Shirakawa;M.;Takumi Ueda
• 通讯作者: Takumi Ueda

Tamiji Nakanishi: "Determination of the Interface of a Large Protein Complex by Transferred Cross-saturation Measurements"J.Mol.Biol.. 318. 245-249 (2002)

Tamiji Nakanishi：“通过转移交叉饱和度测量确定大蛋白复合物的界面”J.Mol.Biol.. 318. 245-249 (2002)