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繋留因子群の立体構造解析による膜融合制御機構の解明

通过束缚因子的三维结构分析阐明膜融合控制机制

基本信息

批准号：
16044214
负责人：
深井周也
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

オルガネラ間の物質輸送は小胞を介して行われる.目的の部位に到達した小胞は,標的膜と融合することによって積荷を受け渡す.繋留因子は,膜融合の初期段階で,小胞とその標的膜とを特異的に繋留することによって輸送の特異性を保証する.繋留因子は,3-8個のサブユニットから構成されるタンパク質複合体であり,低分子量GTPaseとの相互作用によってヌクレオチド依存的に制御されている.本研究では,開口放出で働くExocyst複合体の立体構造をX線結晶構造解析あるいは電子顕微鏡によって決定し,繋留の物理的機構とその制御機構を明らかにする.さらに,変異体をつかって細胞レベル,in vitroでの解析を行い,機能の面からの裏付けを行う.今年度は,ほ乳類のExocyst複合体の電子顕微鏡による解析と,酵母のExocyst複合体と結合するSec4のGEFであるSec2のX線結晶構造解析を行なった.Exocyst複合体は,ブタ脳あるいはラット脳から精製し,電子顕微鏡をつかって,酢酸ウラニルによる負染色像を観察した.当初は,粒子の均一性に問題があったが,調製方法を改善することにより,Exocyst複合体全体と考えられる約150Åの大きさの粒子を多く観察できるようになった.しかしながら,解離した複合体と考えられる約60Åと120Åの大きさの粒子が依然として残っており,解析の妨げとなっている.粒子の均一性を高めることにより,単粒子解析が可能な試料調製法を確立することが,今後の課題である.また,Exocyst複合体と相互作用するRalのGTPase活性化タンパク質を新規に同定した.in vitroでの活性測定を終え,現在は,細胞レベルでの解析を行なっている.一方,Sec2については,Sec4との相互作用領域の結晶構造を3.0Å分解能で決定した.Sec2のSec4結合領域は,200Åの長さをもつトロポミオシン様のcoiled coilを形成していた.現在,立体構造にもとついてin vitroでの機能解析を進めている.

The material transport between the cells is a process of transformation. The target cell reaches the target cell, and the target membrane is fused. The retention factor ensures the specificity of membrane transport at the initial stage of membrane fusion. The retention factor is composed of 3 -8 molecules, which are dependent on the interaction of low molecular weight GTase. In this study, the three-dimensional structure of the Exocyst complex was determined by X-ray crystallographic analysis, electron microscopy, and the physical mechanism and control mechanism of the Exocyst complex were clarified. In addition, different types of cells, in vitro analysis, functional aspects, etc. This year, X-ray crystal structure analysis of milk Exocyst complex and yeast Exocyst complex combined with GEF of Sec4 and Sec2 was carried out.Exocyst complex was refined, electron microscopy was carried out, and negative staining images were observed. At the beginning, the uniformity of particles was a problem, and the modulation method was improved. The whole Exocyst complex was examined by about 150 particles. The dissociation complex is about 60 ° C and 120 ° C, and the particles are still in existence. Particle homogeneity is high, particle analysis is possible, sample modulation method is established, and future problems are discussed. The Exocyst complex interacts with the GTase activity of Ral.In vitro, the activity assay is completed, and now, the analysis of the cell cycle is performed. One side,Sec2,Sec4,Sec4, Sec 2, Sec4, Sec Now, the three-dimensional structure is in the vitro, and the function analysis is in progress.