Exocyst複合体の再構成と構造解析

Exocyst复合体的重建和结构分析

基本信息

批准号：
20051008
负责人：
深井周也
金额：
$ 4.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

開口放出で働く繋留因子であるexocyst複合体は,Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70, Exo84の8つのサブユニットから構成される分子量約750kDaの複合体である.本研究は,exocyst複合体と,それに相互作用して小胞と細胞膜との繋留の制御を行う低分子量GTPase群との複合体の立体構造解析により,繋留の物理的機構およびその制御機構の構造基盤を確立することを目的とした.電子顕微鏡で得られる二次元投影像を利用した単粒子解析とX線結晶構造解析の双方の利点を生かしながらexocyst複合体の原子モデル構築を行うために,バキュロウイルスの発現系を用いた複合体の再構成を行い,得られた複合体およびサブ複合体の解析を行うことを目標とした.exocyst複合体の各サブユニットを発現するバキュロウイルスを調製し,安定なサブ複合体や複合体全体を発現させるための共感染実験を行ったが,構造解析に適する複合体を得るには至っていない.一方,出芽酵母のexocyst複合体は,Sec3サブユニットのN末端ドメイン(Sec3-N)を介してRho1/Cdc42やイノシトールリン脂質PtdIns(4,5)P_2と結合し,標的膜を認識する.我々は,Sec3-NとRho1との複合体の結晶構造を2.6A分解能で決定し,立体構造に基づいて設計した変異体のin vitroでの結合解析およびin vivoでの局在観察を行うことによって,Sec3サブユニットを介したexocyst複合体の標的膜認識メカニズムを明らかにした(Yamashita et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2010).

外囊复合物是在打开射血中起作用的束缚因子，是Sec3，sec5，sec6，sec8，sec10，sec15，sec15，exo70，这是一个约750 kDa分子量的复合物，由八个exo84亚基组成。这项研究旨在通过对胞外复合物和低分子量GTPase组之间的复合物进行络合的物理机理及其控制机制的结构基础，该分析与其相互作用以控制囊泡和细胞膜之间的束缚。为了构建外囊体复合物的原子模型，利用单个粒子分析和X射线晶体学的优势使用通过电子显微镜获得的二维投影图像，使用杆状病毒表达系统重建了复合物，以及所获得的复合物和亚复合物的溶液被解析。目的是进行分析。我们制备了表达外囊复合物的每个亚基的细菌病毒，并进行了共感染实验以表达稳定的亚复合物和整个复合物，但没有达到适合结构分析的复合物。同时，发芽酵母的外囊复合物通过SEC3亚基（SEC3-N）的N末端结构域（SEC3-N）结合Rho1/cdc42和肌醇磷脂PTDINS（4,5）P_2并识别靶膜。我们以2.6a分辨率确定了Sec3-N和Rho1复合物的晶体结构，并根据结构设计突变体。通过在体内进行结合分析，在体内进行了定位观测，我们揭示了通过SEC3亚基对胞外囊复合物识别靶膜识别的机制（Yamashita等人，自然结构和分子生物学，2010年）。