ＢＲＣＣ３６複合体によるＫ６３結合型ユビキチン鎖特異的切断メカニズムの解明

BRCC36 复合物对 K63 连接的泛素链特异性切割机制的阐明

基本信息

批准号：
15F15386
负责人：
深井周也
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-11-09 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

BRCC36を触媒サブユニットとする脱ユビキチン化酵素複合体は，K63結合型ユビキチン鎖（K63鎖）を特異的に切断する活性を持ち，DNA損傷応答や炎症・感染応答においてK63鎖を介した分子シグナル経路を制御する．本研究では，BRCC36複合体の一つであるBRISC複合体とK63鎖との複合体の立体構造をX線結晶構造解析や電子顕微鏡解析により決定し，複数の制御サブユニットによって担われるK63鎖特異的な切断機構を解明することを目的とした．初年度にBRISC複合体の結晶化条件と発現コンストラクトの検討により再現性を高めることができたが，高分解能のデータセットを収集するには至らなかった．そこで，昨年度は，結晶の凍結条件の再検討や生物種の変更による分解能の向上を目指したが，構造決定に適する分解能の回折データを得るには至らなかった．結晶構造解析に加えてクライオ電子顕微鏡解析による構造決定も試みたが構造解析に適する粒子像は観察できなかった。今年度は，数残基レベルで発現コンストラクトを調節することでの分解能の向上を試みたが，分解能は改善しなかった。一方で，BRCC36複合体が関与するDNA損傷応答経路で機能するユビキチン結合酵素RNF168によるK63鎖選択的な認識機構の研究も行った．RNF168には2箇所のK63鎖選択的な結合領域が存在することを示し，その認識機構を複合体の結晶構造解析と変異体の相互作用解析により明らかにした（Takahashi et al., Nat. Commun., 2018）．

含有BRCC36作为催化亚基的去泛素酶配合物具有特异性切割K63连接的泛素链（K63链）的活性，并在DNA损伤反应和炎症反应和感染反应中通过K63链通过K63链条调节分子信号通路。这项研究旨在通过X射线晶体结构分析和电子显微镜分析来确定Brisc络合物的三维结构，BRCC36复合物之一和K63链复合物，并阐明由多个调节性亚基携带的K63链特异性裂解机制。尽管第一年的结晶条件和表达构建体可以提高可重复性，但我们无法收集高分辨率数据集。因此，去年，我们旨在通过重新审查晶体的冻结条件和变化的生物物种来改善分辨率，但我们无法获得适合结构确定的分辨率的衍射数据。除了晶体结构分析外，我们还尝试使用冷冻电子显微镜分析来确定结构，但是没有观察到适合结构分析的粒子图像。今年，我们试图通过在几个残基的水平上调节表达构建体来改善分辨率，但分辨率并没有改善。另一方面，我们还研究了泛素偶联酶RNF168的K63链选择性识别的机制，该酶在涉及BRCC36复合物的DNA损伤响应途径中起作用。结果表明，RNF168具有两个K63链选择区域，其识别机制是通过对突变体的复杂和相互作用分析的晶体结构分析揭示的（Takahashi等，Nat。Commun。，2018）。