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開口放出を制御するタンパク質複合体群の立体構造解析

控制胞吐作用的蛋白质复合物的三维结构分析

基本信息

批准号：
17053007
负责人：
深井周也
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

開口放出は,神経伝達物質や顆粒の放出,受容体の細胞表面への呈示に関わる重要な生命現象であり,積荷を載せた小胞が,細胞膜と融合することにより起きる.小胞と細胞膜との融合は,繋留因子と呼ばれるタンパク質複合体が,小胞膜と標的膜とを繋留した後,小胞膜上のSNAREと標的膜上の別のSNAREが複合体を形成し,小胞膜と標的膜が互いに引き寄せられることによって生じると考えられている.また,これら一連のタンパク質間相互作用によって行われる膜融合反応は,Rabを初めとする特定の低分子量GTPaseとの相互作用によってGTP依存的に制御されている.低分子量GTPaseは,GTP・GDPの結合により,活性・不活性型の変換を行うが,GTP型からGDP型への変換は,GTPase活性化タンパク質(GAP),そしてGDP型からGTP型への変換は,グアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の助けを借りて行われる.本研究では,膜融合反応に重要な低分子量GTPaseとそのエフェクター,GEF,およびGAPの立体構造をX線結晶構造解析あるいは電子顕微鏡によって決定し,低分子量GTPaseによる膜融合制御機構をタンパク質の立体構造に基づいて理解することを目的とする.今年度は,Ral GTPaseのエフェクターであり,繋留因子として働くExocyst複合体(分子量760kDa)の電子顕微鏡による解析と,Sec4(酵母のRab GTPase)のGEFであるSec2のX線結晶構造解析を行なった.Exocyst複合体は,ブタ脳あるいはラット脳から,精製し,電子顕微鏡をつかって,酢酸ウラニルによる負染色像を観察した.当初は,粒子の均一性に問題があったが,精製条件を改善することにより,Exocyst複合体全体と考えられる約150Åの大きさの粒子を多く観察できるようになった.しかしながら,解離した複合体と考えられる約60Åと120Åの大きさの粒子が依然として残っており,解析の妨げとなっている.粒子の均一性を高めることにより,単粒子解析が可能な試料調製法を確立することが,今後の課題である.また,極低温電子顕微鏡による解析および結晶化に向けて,試料調製のスケールアップも行ないたい.一方,Sec2については,Sec4との相互作用領域の結晶構造を3.0Å分解能で決定した(R_<free>=0.29).Sec2のSec4結合領域は,二量体であり,200Åの長さをもつトロポミオシン様のcoiled coilを形成していた.現在,立体構造にもとづいてin vitroおよびin vivoでの機能解析を進めている.また,得られた立体構造情報を利用して,GEF活性を担う領域全体とSec4との複合体の結晶構造解析を進めて行く.

Open emission, release of substances and particles, cell surface display of receptors are important life phenomena, charge accumulation, cell fusion, cell membrane fusion, etc. Cell membrane fusion, retention factor, cell membrane fusion, cell fusion The membrane fusion reaction,Rab, and the interaction between specific low molecular weight GTases and GTP-dependent GTP-binding. Low molecular weight GTPase-GTP-GDP binding, active/inactive conversion, GTPase-GTP-GDP conversion, GTPase-GAP conversion, GTPase-GTP-GTP conversion, GTPase-GAP conversion, GTPase-GTP conversion, GTPase-GAP conversion, GTPase-GTP conversion, and GEF conversion. In this study, the membrane fusion control mechanism of low molecular weight GTase was determined by X-ray crystallographic analysis and electron microscopy, and the basic understanding of the three-dimensional structure of low molecular weight GTase was discussed. This year, the X-ray crystal structure analysis of Ral GTase and its retention factor and the GEF of Sec4(yeast Rab GTase) were carried out. The X-ray crystal structure analysis of Sec2 was carried out. The Exocyst complex was examined by electron microscopy. At the beginning, the homogeneity of particles was improved, and the purification conditions were improved. The whole Exocyst complex was examined. The particle size was about 150 mm. The dissociation complex is about 60 ° C and 120 ° C, and the particles are still in existence. Particle homogeneity is high, particle analysis is possible, sample modulation method is established, and future problems are discussed. Cryogenic electron microscopy analysis and crystallization, sample modulation and sample preparation. The crystal structure of the interaction domain of Sec2 and Sec4 is determined by the decomposition energy (R_<free>=0.29). The crystal structure of Sec 2 and Sec4 is determined by the decomposition energy (R_ =0.29). The crystal structure of Sec 2 and Sec4 is determined by the decomposition energy (R_= 0.29). Now, the three-dimensional structure is in vitro and in vivo, and the functional analysis is in progress. The GEF activity is responsible for the analysis of the crystal structure of the complex in the whole domain.