ASC依存性アポトーシスの分子機構とPYNODの抑制効果の検討

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ASCはCARD12等と結合してアポトーシス等を誘導する細胞質蛋白質で、その遺伝子は様々ながん組織で発現が抑制されている。しかし、ASCのアポトーシス誘導機構は明確になっていない。我々は、CARD12とNod2の融合蛋白(C12N2)を発現させ、MDP(Nod2のリガンド)でASC依存性アポトーシスを誘導する実験系を開発した。本研究では、この実験系を用いASC依存性アポトーシスの分子機構を検討した。さらに、我々が最近発見した新規ASC阻害蛋白PYNODについて、がん細胞における発現とASC誘導アポトーシスに対する効果を検討した。結果は以下の通りである。1)種々のがん細胞にC12N2とASCを発現させ、MDPで刺激したところ、調べた全ての細胞株でアポトーシスが誘導された。2)種々のドミナントネガティブ(DN)変異体やsiRNA、カスパーゼ阻害剤などを用いた検討から、ASCはFADD非依存性にカスパーゼ8を介してアポトーシスを誘導し、さらにタイプ2細胞においてはカスパーゼ8で切断されるBid依存性に、ミトコンドリア経路のアポトーシスを誘導することが判明した。3)ASCとカスパーゼ8は細胞内でスペックと呼ばれる凝集塊に共局在した。一方、FADD, Bax, Nod2などとの共局在は認められなかった。4)組替ヒトPYNOD蛋白を特異的に検出する単クローン抗体の樹立に成功した。5)この抗体を用い、PYNOD mRNAの発現が確認された10種類のヒトがん細胞株についてPYNOD蛋白の検出を試みたが、検出できなかった。内在性PYNODの検出にはより高親和性の抗体が必要と思われる。6)PYNODを細胞に一過性に発現させるとASC依存性アポトーシスを阻害した。以上、ASCは種々のがん細胞にカスパーゼ8依存性のアポトーシスを誘導し、PYNODはこのアポトーシスを抑制しうることが判明した。