翻訳分子機械の1分子観察系の構築

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当研究は、翻訳過程をを1分子観察系によって解析したものであり、翻訳終結で新たな概念を生み出したものである。1分子観察系の標的を、複合体を構成する成分の脱着の前後関係にして、従来論争になっている翻訳終了時におけるリボソーム50S/30Sサブユニットの解離とmRNAの解離との前後関係の決定に絞り込んだ。つまり、翻訳終了時にmRNAは70Sリボソームから解離するか、30Sとの複合体として50Sから解離するのか次に述べる系をもちいて、検討を進めた。1.大腸菌リボソームを30Sを用いて表面固定した。固定には、His-tagged GFP融合リボソームをもちいて、非特異的吸着の少ない基板として、NTA/cysteineコートされたスライドガラスを開発した。固定されたHis-taggged GFP融合リボソームのは、GFPと融合したタンパク質を持つので、NTAが固定化してある部位に特異的に固定されることが光学的に確認できた。2.固定化リボソームの活性は、固定されたリボソームを、Mg^<2+>イオンを含まない溶液に露出すると、スライドガラスから、50S粒子に固定されたGFPの蛍光が消失したので、固定化されたリボソームは、50S/30S解離のMg^<2+>イオン依存性を保持していた。タンパク質合成活性は、His tag-とLumio-tagをコードしているmRNAとリボソームを含まないS100画分を混ぜることにより、Lumio-tagの蛍光を発する物質が基盤に固定されることから確認できた。3.mRNAは,5'末に蛍光ラベルを導入して、50SのGFPと区別した。その結果、得られた回答はだれも予想していなかったものであった。両方の過程が並列に起こるというものであった。この結果は、当研究室で明らかにされた、転写開始でのBranched pathway mechanismと同質のものであり、合目的に単純に考えられたステップを段階的に並べたものではないことが、翻訳系でも明らかになった。つまり、化学的な反応ステップを直列に並べたものが、生理的な機構ではないことをしめしていた。転写の場合は、この発見は、abortive productsという生理的意義が未知であったものが、実は調節のための副産物であったという発見につながったので、翻訳終結の新展開につながる結果である。