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固定化オペロンを用いたRNAポリメラーゼのDNA上運動の解析

使用固定操纵子分析 RNA 聚合酶在 DNA 上的运动

基本信息

批准号：
63580214
负责人：
嶋本伸雄
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、大腸菌のシステムに、担体に固定化した鋳型DNA(固定化オペロン)を用いた新しい手法で、転写に伴うRNAポリメラーゼを中心とする転写複合体の、時間的な変化を検出することである。つまり、素早い混合によって転写を同調して開始させ、続いて、転写複合体に結合した蛋白分子と遊離の分子とを、急速ろ過または大過剰希釈によって分離して、複合体の構造を明らかにするというものである。本年度の成果は、1.λファージの強いプロモーターPRを持つ1.2kbのλDNAをpBR322にクローンし、EcoRI端をビオチン化してアビジンアクリルアミドに固定して、固定化オペロンを作製した。2.同期した転写を開始して、2秒から10秒後の1000倍に転写時と同じ緩衝液で大過剰希釈して、低速遠心で遊離の蛋白を除き、転写複合体中のσサブユニットを定量した。σ解離は、大過剰希釈により凍結され、約5秒でσサブユニットが解離する過程が追跡できた。3.希釈緩衝液中にATPやCTPが存在すると、2秒でもσは解離しており、σ解離は凍結されなかった。つまり、σの解離が凍結されたのは、ヌクレオシド三燐酸が除かれたためであった。ATPの非水解アナログを用いて、ATPのβγ燐酸ジエステル結合がσ解離に必要であることが示された。このことは、σの解離には、転写の開始とヌクレオシド三燐酸のβγ燐酸ジエステル結合の水解が必要であり、RNAの伸長だけでは不十分であることを明らかにした。

The purpose of this study is to develop a novel method for the immobilization of E. coli DNA on a carrier, and to develop a novel method for the immobilization of DNA on a carrier. The structure of the complex is clearly defined by the structure of the complex, the structure of the complex, and the structure of the complex. This year's results include: 1. The strong selection of λDNA from pBR322, the selection of EcoRI terminal, the selection of immobilized DNA, and the selection of immobilized DNA 2. At the same time, the writing time is 1000 times after 2 seconds, and the writing time is 10 seconds. The buffer solution is too large, and the free protein is removed at low speed. The writing complex is quantified. The dissociation process is tracked in about 5 seconds. 3. ATP and CTP are not present in buffer solution for 2 seconds.つまり、σの离解が冻结されたのは、ヌクレオシド三磷酸が除かれたためであった。ATP non-hydrolytic degradation, ATP βγ phosphate binding, σ dissociation, and so on. This is the beginning of the process of hydrolysis of triphosphate and βγ-phosphate.