FLIM-FRET測定とRNAiを用いた薬物による遺伝子発現誘導機構の解析

ピコ秒パルスレーザー,蛍光顕微鏡,時間空間相関単一光子計数検出器,時間電圧変換器を組み合わせることによりFLIM-FRET測定を行う蛍光顕微鏡システムを構築し、外来薬物による遺伝子誘導において機能する転写因子AhR(Aryl hydrocarbon Receptor)の生細胞内での構造変換の検出を試みた。蛍光タンパク質を融合したAhRを培養細胞(CHO-K1)において発現させ、薬物として3-Methylcholanthrene(3-MC)を投与してAhRの構造変換や他の因子との相互作用の変化の検出を試みたが、AhRの発現量等の問題により蛍光寿命の変化としてのシグナルは検出できなかった。しかし、AhRと核内で二量体を形成する転写因子Arntに蛍光タンパク質を融合し発現させた実験系では生細胞内でのArntのホモ二量体形成をはじめて検出することが出来た。したがってこの実験システムが生細胞内での転写因子の相互作用及び構造変換の解析に有用であることが示されたが、AhRの解析には更なる条件の検討が必要であると考えられる。さらに薬物代謝に重要なCYP1A2の3-MCによる誘導にXREII配列を介して機能する転写因子LBP1の調節機構を解析した。LBP-1aのスプライシングアイソフォームであるLBP-1bに存在するexon 6によってコードされる領域が核移行シグナルとして機能し、LBP-1a及び別の遺伝子産物であるLBP-1cがLBP-1bの核移行能により核へ移行し転写因子として機能することを明らかにした。さらにLBP-1b特異的なRNAiによる発現抑制系を構築し、LBP-1bを特異的に抑制することによりXREIIを介した薬物応答能が抑制されることを明らかにした。

ピコ秒パルスレーザー,蛍光顕微鏡,時間空間相関単一光子計数検出器,時間電圧変換器を組み合わせることによりFLIM-FRET測定を行う蛍光顕微鏡システムを構築し、外来薬物による遺伝子誘導において機能する転写因子AhR(Aryl hydrocarbon Receptor)の生細胞内での構造変換の検出を試みた。蛍光タンパク質を融合したAhRを培養細胞(CHO-K1)において発現させ、薬物として3-Methylcholanthrene(3-MC)を投与してAhRの構造変換や他の因子との相互作用の変化の検出を試みたが、AhRの発現量等の問題により蛍光寿命の変化としてのシグナルは検出できなかった。しかし、AhRと核内で二量体を形成する転写因子Arntに蛍光タンパク質を融合し発現させた実験系では生細胞内でのArntのホモ二量体形成をはじめて検出することが出来た。したがってこの実験システムが生細胞内での転写因子の相互作用及び構造変換の解析に有用であることが示されたが、AhRの解析には更なる条件の検討が必要であると考えられる。さらに薬物代謝に重要なCYP1A2の3-MCによる誘導にXREII配列を介して機能する転写因子LBP1の調節機構を解析した。LBP-1aのスプライシングアイソフォームであるLBP-1bに存在するexon 6によってコードされる領域が核移行シグナルとして機能し、LBP-1a及び別の遺伝子産物であるLBP-1cがLBP-1bの核移行能により核へ移行し転写因子として機能することを明らかにした。さらにLBP-1b特異的なRNAiによる発現抑制系を構築し、LBP-1bを特異的に抑制することによりXREIIを介した薬物応答能が抑制されることを明らかにした。