FLIM-FRET測定とRNAiを用いた薬物による遺伝子発現誘導機構の解析

使用 FLIM-FRET 测量和 RNAi 分析药物基因表达诱导机制

• 批准号: 17054002
• 负责人: 安元 研一
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17054002/
• 关键词: 薬物応答; 転写因子; 遺伝子調節; 蛍光顕微鏡; FLIM-FRET; AhR; LBP-1; CYP1A2

ピコ秒パルスレーザー,蛍光顕微鏡,時間空間相関単一光子計数検出器,時間電圧変換器を組み合わせることによりFLIM-FRET測定を行う蛍光顕微鏡システムを構築し、外来薬物による遺伝子誘導において機能する転写因子AhR(Aryl hydrocarbon Receptor)の生細胞内での構造変換の検出を試みた。蛍光タンパク質を融合したAhRを培養細胞(CHO-K1)において発現させ、薬物として3-Methylcholanthrene(3-MC)を投与してAhRの構造変換や他の因子との相互作用の変化の検出を試みたが、AhRの発現量等の問題により蛍光寿命の変化としてのシグナルは検出できなかった。しかし、AhRと核内で二量体を形成する転写因子Arntに蛍光タンパク質を融合し発現させた実験系では生細胞内でのArntのホモ二量体形成をはじめて検出することが出来た。したがってこの実験システムが生細胞内での転写因子の相互作用及び構造変換の解析に有用であることが示されたが、AhRの解析には更なる条件の検討が必要であると考えられる。さらに薬物代謝に重要なCYP1A2の3-MCによる誘導にXREII配列を介して機能する転写因子LBP1の調節機構を解析した。LBP-1aのスプライシングアイソフォームであるLBP-1bに存在するexon 6によってコードされる領域が核移行シグナルとして機能し、LBP-1a及び別の遺伝子産物であるLBP-1cがLBP-1bの核移行能により核へ移行し転写因子として機能することを明らかにした。さらにLBP-1b特異的なRNAiによる発現抑制系を構築し、LBP-1bを特異的に抑制することによりXREIIを介した薬物応答能が抑制されることを明らかにした。

A fluorescent microscope system was constructed to perform FLIM-FRET measurements by combining a picosecond pulsed laser, a fluorescence microscope, a time-space-correlated single-photon count detector, and a time-voltage converter, and attempted to detect the structural transformation of the transcription factor AhR (Aryl hydrocarbon receptor), which functions in gene induction by foreign drugs, in living cells.在培养细胞（CHO-K1）中表达与荧光蛋白融合的AHR，并用作3-甲基胆碱（3-MC）作为药物，以检测AHR结构的变化并与其他因素相互作用，但是由于诸如AHR表达水平等问题，无法检测到AHR的表达水平，无法检测到荧光寿命的变化。但是，在一个实验系统中，通过将AHR与转录因子ARNT融合表达荧光蛋白的实验系统（在细胞核中形成二聚体）能够首次检测活细胞中ARNT的同型二聚体形成。因此，尽管该实验系统已被证明可用于分析活细胞内的转录因子相互作用和结构转化，但认为进一步的考虑对于AHR的分析是必需的。此外，我们分析了转录因子LBP1的调节机制，该机理通过CYP1A2的XREII序列诱导起作用，这对于药物代谢至关重要，这对于药物代谢很重要。据表明，LBP-1B中的外显子6编码的区域，LBP-1A的剪接同工型，作为核转运信号，LBP-1A和另一个基因产物LBP-1C，通过LBP-1B的核易位能力转移到核，并用作转录因子。此外，我们已经构建了RNAi特有对LBP-1B的表达抑制系统，并揭示了XREII介导的药物反应能力通过特异性抑制LBP-1B抑制。