色素細胞分化におけるWntシグナル関連因子とMITFとの機能的相互作用

Wnt信号相关因子与MITF在色素细胞分化中的功能相互作用

基本信息

批准号：
12028202
负责人：
安元研一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12028202/
关键词：
tyrosinase gene expression microphthalmia MITF transcriptional regulation TRP-2 LEF-1 Wnt

项目摘要

メラノサイト、網膜色素上皮細胞(RPE)の分化過程に機能する転写因子MITFの作用機構を明らかにする事を目的とし、特に発生や形態形成に重要なWntシグナルの伝達経路の因子とMITFとの機能的相互作用に注目して以下の解析を行った。1.MITFとLEF-1/β-Cateninによる転写調節機構の解析MITF-MがWntタンパクにより発現が誘導されることを見出し、Wntシグナル伝達因子LEF-1がMITF-Mプロモーターを制御している事を報告した。さらにMITFとLEF-1との協調作用によりメラノブラストマーカーであるTRP-2のプロモーター活性が上昇する事を見出した。この機構にはβ-Cateninの存在が必要であった。さらにPull Down Assay及び酵母、培養細胞でのTwo-Hybrid法により、MITFとLEF-1が相互作用する事を明らかにした。欠失変異体を用いた実験によりこの相互作用に必要な領域として、MITFのbasic-helix-loop-helix/leucine zipper(bHLH/LZ)領域と、LEF-1の核移行シグナル領域を同定した。2.MITF-A knock outマウスの作成とその表現型の解析Mitf-rwマウスはMitf遺伝子の1H及び1Bエキソンを含む領域を欠失しており、その結果RPEのメラニン色素形成に異常を来しているという報告がなされた。したがってRPEの分化と機能発現にはMitf-M以外のisoform(A、B、C、H)が機能している事が示唆される。この報告を踏まえてRPEの分化におけるMitf-Aの発現をさらに詳細に検討した。その結果RPEの分化に重要な機能を果たしていると思われる新規のisoformを見出した。さらにMITFとSOX10についてin situ hybridization法により発生過程における発現分布を解析して報告した。3.RPEにおけるMITFの新規標的遺伝子の探索RPEにおいてMITFの野生型と変異型を構成的に発現させた培養RPEを作成し、cDNAサブトラクション法によるMITFの標的遺伝子の単離を試みた。サブトラクション後のcDNAでは構成的に発現している遺伝子は除かれている事を確認し、発現量に差のあるcDNAクローンの単離を進めている。

目的是阐明MITF的作用机理，MITF的作用机理是一种转录因子，该转录因子在黑色素细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE）的分化过程中起作用，并进行了以下分析，特别关注Wnt信号转导途径中因子之间的功能相互作用，这对于发育和形式生成和形式生成和MITF。 1。通过MITF和LEF-1/β-catenin对转录调控机制的分析，我们发现表达是由Wnt蛋白诱导的，并报告说Wnt信号因子LEF-1调节MITF-M启动子。此外，发现MITF和LEF-1的合作增加了黑素细胞标记TRP-2的启动子活性。该机制需要β-catenin的存在。此外，揭示了MITF和LEF-1与酵母和培养细胞中的两杂化方法相互作用。使用缺失突变体的实验将MITF的基本螺旋 - 环螺旋/亮氨酸拉链（BHLH/LZ）区域和LEF-1的核易位信号区域确定为这种相互作用所需的区域。 2。产生MITF-A敲出小鼠并分析其表型，据报道MITF-RW小鼠删除了含有MITF基因的1H和1B外显子的区域，导致RPE中黑色素色素形成的异常。因此，建议除MITF-M（A，B，C，H）以外的其他同工型在RPE分化和功能表达中起作用。基于该报告，更详细地检查了RPE分化过程中MITF-A的表达。结果，我们发现了一种新型的同工型，在RPE差异化中似乎起着重要作用。此外，通过原位杂交分析了开发过程中的表达分布并在MITF和SOX10上进行了报告。 3。在RPE中寻找MITF的新型靶基因，我们创建了一种培养的RPE，该RPE组成了MITF的野生型和突变形式，并试图通过CDNA减法分离MITF的靶基因。据证实，减法后在cDNA中除去了组成型表达的基因，并分离了具有不同表达水平的cDNA克隆。