色素細胞分化におけるWntシグナル関連因子とMITFとの機能的相互作用

メラノサイト、網膜色素上皮細胞(RPE)の分化過程に機能する転写因子MITFの作用機構を明らかにする事を目的とし、特に発生や形態形成に重要なWntシグナルの伝達経路の因子とMITFとの機能的相互作用に注目して以下の解析を行った。1.MITFとLEF-1/β-Cateninによる転写調節機構の解析MITF-MがWntタンパクにより発現が誘導されることを見出し、Wntシグナル伝達因子LEF-1がMITF-Mプロモーターを制御している事を報告した。さらにMITFとLEF-1との協調作用によりメラノブラストマーカーであるTRP-2のプロモーター活性が上昇する事を見出した。この機構にはβ-Cateninの存在が必要であった。さらにPull Down Assay及び酵母、培養細胞でのTwo-Hybrid法により、MITFとLEF-1が相互作用する事を明らかにした。欠失変異体を用いた実験によりこの相互作用に必要な領域として、MITFのbasic-helix-loop-helix/leucine zipper(bHLH/LZ)領域と、LEF-1の核移行シグナル領域を同定した。2.MITF-A knock outマウスの作成とその表現型の解析Mitf-rwマウスはMitf遺伝子の1H及び1Bエキソンを含む領域を欠失しており、その結果RPEのメラニン色素形成に異常を来しているという報告がなされた。したがってRPEの分化と機能発現にはMitf-M以外のisoform(A、B、C、H)が機能している事が示唆される。この報告を踏まえてRPEの分化におけるMitf-Aの発現をさらに詳細に検討した。その結果RPEの分化に重要な機能を果たしていると思われる新規のisoformを見出した。さらにMITFとSOX10についてin situ hybridization法により発生過程における発現分布を解析して報告した。3.RPEにおけるMITFの新規標的遺伝子の探索RPEにおいてMITFの野生型と変異型を構成的に発現させた培養RPEを作成し、cDNAサブトラクション法によるMITFの標的遺伝子の単離を試みた。サブトラクション後のcDNAでは構成的に発現している遺伝子は除かれている事を確認し、発現量に差のあるcDNAクローンの単離を進めている。

メラノサイト、網膜色素上皮細胞(RPE)の分化過程に機能する転写因子MITFの作用機構を明らかにする事を目的とし、特に発生や形態形成に重要なWntシグナルの伝達経路の因子とMITFとの機能的相互作用に注目して以下の解析を行った。1.MITFとLEF-1/β-Cateninによる転写調節機構の解析MITF-MがWntタンパクにより発現が誘導されることを見出し、Wntシグナル伝達因子LEF-1がMITF-Mプロモーターを制御している事を報告した。さらにMITFとLEF-1との協調作用によりメラノブラストマーカーであるTRP-2のプロモーター活性が上昇する事を見出した。この機構にはβ-Cateninの存在が必要であった。さらにPull Down Assay及び酵母、培養細胞でのTwo-Hybrid法により、MITFとLEF-1が相互作用する事を明らかにした。欠失変異体を用いた実験によりこの相互作用に必要な領域として、MITFのbasic-helix-loop-helix/leucine zipper(bHLH/LZ)領域と、LEF-1の核移行シグナル領域を同定した。2.MITF-A knock outマウスの作成とその表現型の解析Mitf-rwマウスはMitf遺伝子の1H及び1Bエキソンを含む領域を欠失しており、その結果RPEのメラニン色素形成に異常を来しているという報告がなされた。したがってRPEの分化と機能発現にはMitf-M以外のisoform(A、B、C、H)が機能している事が示唆される。この報告を踏まえてRPEの分化におけるMitf-Aの発現をさらに詳細に検討した。その結果RPEの分化に重要な機能を果たしていると思われる新規のisoformを見出した。さらにMITFとSOX10についてin situ hybridization法により発生過程における発現分布を解析して報告した。3.RPEにおけるMITFの新規標的遺伝子の探索RPEにおいてMITFの野生型と変異型を構成的に発現させた培養RPEを作成し、cDNAサブトラクション法によるMITFの標的遺伝子の単離を試みた。サブトラクション後のcDNAでは構成的に発現している遺伝子は除かれている事を確認し、発現量に差のあるcDNAクローンの単離を進めている。