外来薬物による遺伝子発現誘導における転写因子複合体の機能解析

蛍光の寿命の変化を測定するシステムとして、ピコ秒パルスレーザー・蛍光顕微鏡・時間空間相関単一光子計数検出器・時間電圧変換器を組み合わせたFLIM-FRET測定システムの開発を進めた。従来の蛍光強度の変化を測定する方法と比較すると、蛍光寿命の変化を測定することにより他の分子からの蛍光による影響を排除することができ、さらにFRETによる蛍光寿命の変化が蛍光分子間の距離に依存することから、生体分子の構造変化や相互作用の変化を測定できる利点がある。このFHM-FRET測定システムを用いた解析対象として、外来薬物3-Methylcholanthrene(3-MC)をリガンドとする薬物受容体AhRとそのパートナー因子Arntによる標的遺伝子の活性化機構の解析を行った。特にArntの核内における局在と二量体形成との関連についてこのシステムによる解析を行い、核内スペックルにおいてホモ二量体を形成しているがその他の核内領域ではホモ二量体は形成されていないことを見いだした。さらにレポーターとしてmRFPを用いることにより単一生細胞におけるレポーターの活性を測定する系を構築した。Arntの核内局在は核一様に存在している場合とスペックルを形成している場合がある。そこでArntの核内局在とレポーターの活性との相関関係を測定したところ、スペックル形成と共に転写活性を有する細胞の分布が増加していることが示された。したがってArntの核内スペックルにおけるホモ二量体形成がレポーターの転写活性化に重要であることが示された。このシステムでは細胞の「集団」を用いた実験では明らかになりにくい転写因子の機能を単一生細胞で観察することにより明らかにすることができた。

蛍光の寿命の変化を測定するシステムとして、ピコ秒パルスレーザー・蛍光顕微鏡・時間空間相関単一光子計数検出器・時間電圧変換器を組み合わせたFLIM-FRET測定システムの開発を進めた。従来の蛍光強度の変化を測定する方法と比較すると、蛍光寿命の変化を測定することにより他の分子からの蛍光による影響を排除することができ、さらにFRETによる蛍光寿命の変化が蛍光分子間の距離に依存することから、生体分子の構造変化や相互作用の変化を測定できる利点がある。このFHM-FRET測定システムを用いた解析対象として、外来薬物3-Methylcholanthrene(3-MC)をリガンドとする薬物受容体AhRとそのパートナー因子Arntによる標的遺伝子の活性化機構の解析を行った。特にArntの核内における局在と二量体形成との関連についてこのシステムによる解析を行い、核内スペックルにおいてホモ二量体を形成しているがその他の核内領域ではホモ二量体は形成されていないことを見いだした。さらにレポーターとしてmRFPを用いることにより単一生細胞におけるレポーターの活性を測定する系を構築した。Arntの核内局在は核一様に存在している場合とスペックルを形成している場合がある。そこでArntの核内局在とレポーターの活性との相関関係を測定したところ、スペックル形成と共に転写活性を有する細胞の分布が増加していることが示された。したがってArntの核内スペックルにおけるホモ二量体形成がレポーターの転写活性化に重要であることが示された。このシステムでは細胞の「集団」を用いた実験では明らかになりにくい転写因子の機能を単一生細胞で観察することにより明らかにすることができた。