外来薬物による遺伝子発現誘導における転写因子複合体の機能解析

转录因子复合物在外源药物诱导基因表达中的功能分析

基本信息

批准号：
18055001
负责人：
安元研一
金额：
$ 4.42万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18055001/
关键词：
FLIM-FRET 薬物応答転写因子複合体 Arnt AhR 遺伝子調節蛍光顕微鏡転写因子 LBP-1 CYP1A2

项目摘要

蛍光の寿命の変化を測定するシステムとして、ピコ秒パルスレーザー・蛍光顕微鏡・時間空間相関単一光子計数検出器・時間電圧変換器を組み合わせたFLIM-FRET測定システムの開発を進めた。従来の蛍光強度の変化を測定する方法と比較すると、蛍光寿命の変化を測定することにより他の分子からの蛍光による影響を排除することができ、さらにFRETによる蛍光寿命の変化が蛍光分子間の距離に依存することから、生体分子の構造変化や相互作用の変化を測定できる利点がある。このFHM-FRET測定システムを用いた解析対象として、外来薬物3-Methylcholanthrene(3-MC)をリガンドとする薬物受容体AhRとそのパートナー因子Arntによる標的遺伝子の活性化機構の解析を行った。特にArntの核内における局在と二量体形成との関連についてこのシステムによる解析を行い、核内スペックルにおいてホモ二量体を形成しているがその他の核内領域ではホモ二量体は形成されていないことを見いだした。さらにレポーターとしてmRFPを用いることにより単一生細胞におけるレポーターの活性を測定する系を構築した。Arntの核内局在は核一様に存在している場合とスペックルを形成している場合がある。そこでArntの核内局在とレポーターの活性との相関関係を測定したところ、スペックル形成と共に転写活性を有する細胞の分布が増加していることが示された。したがってArntの核内スペックルにおけるホモ二量体形成がレポーターの転写活性化に重要であることが示された。このシステムでは細胞の「集団」を用いた実験では明らかになりにくい転写因子の機能を単一生細胞で観察することにより明らかにすることができた。

我们一直在开发一个Flim-fret测量系统，该系统结合了皮秒脉冲激光器，荧光显微镜，时空相关单光子计数检测器和时间电压转换器，作为测量荧光寿命变化的系统。与测量荧光强度变化的常规方法相比，可以通过测量荧光寿命的变化以及由于FRET引起的荧光寿命的变化取决于荧光分子之间的距离，可以消除其他分子的荧光影响，这取决于荧光分子之间的距离，这是可以衡量在结构和相互作用中的优势。使用此FHM-FRET测量系统分析了靶基因激活的目标机制，使用外来药物3-甲基胆碱（3-MC）作为配体及其伴侣因子ARNT。特别是，使用该系统进行了在ARNT核与二聚体形成的定位之间的关联，并发现在核斑点中形成同型二聚体，但在其他核区域中没有形成同型二聚体。此外，通过将MRFP用作记者，构建了一个系统来测量单个活细胞中报告者的活性。 ARNT的核定位可能统一存在于核中，可能形成斑点。因此，测量了ARNT的核定位和报告基因活性之间的相关性，并表明具有转录活性的细胞分布随斑点形成而增加。因此，ARNT核斑点中的同型二聚体形成对于报告基因转录激活很重要。该系统能够阐明转录因子的功能，这些因子在实验中难以通过观察单个活细胞的“人群”而难以揭示。