大脳皮質回路形成過程のGABAA受容体・C1-輸送体・タウリンの機能協関

GABAA受体、C1转运蛋白和牛磺酸在大脑皮层回路形成过程中的功能配合

基本信息

批准号：
18021015
负责人：
福田敦夫
金额：
$ 4.22万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

1. Cl^-トランスポーターknock-downによる細胞移動の[Cl^-]_i依存性の検討[熊田、福田]:NKCC1 mRNAの転写を干渉するshRNAをコードするコンストラクトのプラスミドを調整し、計画1.で用いたHcRedプラスミドと同時に電気穿孔法で胎仔脳室帯の新生神経細胞に導入した。2種類のプラスミドは90%以上の高率で同一の細胞に導入されるので、HcRedを発現レた細胞にはSiRNAも導入されていることになる。こうしてNKCC1遺伝子の転写をsiRNAでknock-downして、Cl^-濃度を調節したホールセルパッチクランプで[Cl^-]_iを測定したところ平均値は過分極側にシフトした。しかし、目下のところradial移動の顕著な異常はでていないので、HcRedのみの場合の移動との比較の必要性が示唆された。NKCC1mRNAの減少を確認するためreal-time PCR法を行った。2. 排出型Cl^-輸送体KCC2の機能発現抑制因子の検討[福田・古川]:KCC2にはいくつかのリン酸化部位が知られており、リン酸化あるいは脱リン酸化によってCl^-排出能が抑制されている可能性を検討するため、リン酸化阻害剤(スタウロスポリン)および脱リン酸化阻害剤(5酸化バナジウム酸)をスライスに投与して[Cl^-]_i変化を測定した。しかし、ラット胎生18日の移動細胞ではいずれにおいても変化を認めなかった。ところが、生後1週前後のKCC2が機能し始める時期で同様の実験を行うとKCC2過剰発現細胞において[Cl^-]_iが有意に減少し、広範性リン酸化阻害剤で[Cl^-]_iが低下した。すなわち、生後1週ではリン酸化によるKCC2機能抑制がおこるが、細胞移動期の胎生18日ではこのプロセスが起こらないことが示唆された。

1。检查[Cl^ - ] _ I通过Cl^ - 转运剂敲除[Kumada，Fukuda]的依赖性：编码shRNA的构造的质粒，该构建体的质粒与NKCC1 mRNA的转录进行了调整，并通过ftricular cland pl plling pl plan two two hat two hat two hat two hatcrand tose hat two hat two hat two hat two hat two hat ttwo hyprast in类型。将质粒以90％或以上的高速率引入同一细胞中，siRNA也已引入表达HCRED的细胞中。这样，用siRNA敲除了NKCC1基因的转录，并使用经过Cl^ - 浓度调整的整个细胞贴片夹进行测量，并将平均值转移到超极化侧。但是，目前径向迁移尚无明显的异常，这表明在单独使用HCRED的情况下，有必要将其与迁移进行比较。进行实时PCR以确认NKCC1 mRNA的降低。 2。检查抑制外排型Cl^-Transporter KCC2 [Fukuda，furukawa]表达的因素：在KCC2中已知几个磷酸化位点，并研究Cl^ - 脱脂能力被磷酸化或磷酸化或磷酸化的抑制剂（phosposeplation andosporation andorporiation andorportion andorportion andorportion andorportion andosportor（pan）抑制的可能性（将五氧化物施用到切片中，以测量[Cl^ - ] _更改。但是，在大鼠胚胎生命的18天迁移细胞中未观察到任何变化。但是，当在出生后一周左右开始KCC2开始起作用时进行类似的实验时，[Cl^ - ] _ i在过表达KCC2的细胞中显着降低，而[Cl^ - ] _ I被宽光谱磷酸化抑制剂减少。换句话说，有人建议KCC2功能在出生后一周被磷酸化抑制，但是此过程并非发生在细胞迁移期间胚胎寿命的18天。