大脳皮質形成期の接線方向移動と放射状移動の細胞間クロストークにおけるCl^‐の役割

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1.GFPとHcRed標識による接線方向移動細胞と放射状移動細胞の識別[井上・山田・福田]:GAD67-GFP knock-inマウス(C57BL/6j)胎仔にHcRed遺伝子を胎生14日に電気穿孔法で脳室帯の新生ニューロンに導入し、発達の各段階で脳スライスを作成した。接線方向移動中のGABA細胞(GFP蛍光)と放射状移動中のglutamate細胞(HcRed蛍光)が識別できた。放射状移動細胞は大脳皮質II/III層を形成し、接線方向移動細胞は主に中間帯と辺縁帯を移動し、中間帯から皮質版に進入していた。2.radial移動細胞における細胞内Cl^-濃度とCl^-トランスポーター遺伝子発現変化の解析[福田・窪田・山田・Luhmann]:グラミシジン穿孔パッチクランプ法で、放射状移動中のglutamate細胞のGABA/グリシン反応とCl^-平衡電位を測定して、Cl^-トランスポーターとGABA_A/グリシン受容体mRNAのsingle-cell RT-PCRを行った。その発現パターンを各々の細胞の発生時期や移動状態のちがいで比較し、放射状移動細胞の[Cl^-]_i高値と、定着後の[Cl^-]_i低下に伴うGABA_A/グリシン作用の興奮→抑制転換の分子的要因を明らかにした。また、辺縁帯のCajal-Retzius細胞でもグリシン(タウリン)反応と[Cl^-]_iを解析し、グリシン受容体サブユニット(α1-α3,β)とCl^-トランスポーターのmRNAの発現を解析したところ、NKCC1優位でα2βのヘテロであった。3.電気穿孔法を用いたKCC2強制発現による細胞移動の[Cl^-]_i依存性の証明[福田・井上・窪田]:Flag-KCC2を発現するコンストラクトのプラスミドを調整し、EGFPのプラスミドと同時に電気穿孔法で胎仔脳室帯の同一の新生神経細胞に選択的に導入した。KCC2を強制発現した細胞をEGFP蛍光によって同定したが、radial移動は正常で[Cl^-]_iも高値のままであった。