立体構造規制ペプチドライブラリー:タンパク質標的親和性プローブの網羅的作製法

构象调控肽库：蛋白质靶点亲和探针的综合生产方法

• 批准号: 18038036
• 负责人: 藤井 郁雄
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18038036/
• 关键词: 抗体; ファージライブラリー; ペプチド; キナーゼ; α-ヘリックス; 動的解析

従来,新しいタンパク質を単離した研究者が,最初に考えることは,標的タンパク質に対する抗体を入手することである.免疫染色法により,標的タンパク質の発現量や発現部位を同定することができる.しかしながら,抗体は,多数のジスルフィド結合を含む巨大タンパク質であるため,抗体を細胞内に導入したり細胞内で機能させたりすることができず,生細胞内におけるタンパク質の動的解析には利用できない.そこで,本研究では,抗体にかわって,細胞内への導入が可能な小さく安定な親和性プローブを網羅的かつ体系的に作製する技術を確立する.すなわち,立体構造モチーフ(α-ヘリックスなど)をもつペプチドのファージ表層提示ライブラリーを作製し,構造情報に基づく体系的な,ライブラリーの選別を行う.立体構造を持たせることにより,抗体と同様に,高い特異性と親和性,さらに生細胞内での安定性を獲得することができる.(1)α-ヘリックス構造ペプチドライブラリーの構築:ヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有する35アミノ酸残基からなるペプチド1AAのα-ヘリックス構造の外側5アミノ酸残基をランダム化したペプチドライブラリーをファージ表層に提示させ,ファージライブラリーを構築した.(2)ヘリックス・ヘヤピン構造ペプチドライブラリーの構築:ヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するペプチド1AAのループ部分のアミノ酸5残基をランダム化したペプチドライブラリーをファージ表層に提示させ,ファージライブラリーを構築した.(3)オーロラキナーゼの固定化条件の検討:オーロラキナーゼに対する親和性ペプチドを獲得するにあたり,ファージライブラリーの選別に使用するオーロラAをプレートへ固定化する条件を検討した.IMAPシステムを用いて,オーロラAキナーゼの活性を調べたところ,グルタチオンプレートを用いた固定化,Anti-GST抗体を用いた固定化いずれの場合にもキナーゼ活性は保持されていた。現在,本条件により固定化したオーロラAを用いて親和性ペプチドの獲得を検討している.

従, new し い タ ン パ ク qualitative を 単 from し た researchers が, initially に exam え る こ と は, mark タ ン パ ク qualitative に す seaborne を る antibody of す る こ と で あ る. Immune staining に よ り, mark タ ン パ ク qualitative の 発 now quantity や を 発 now parts with fixed す る こ と が で き る. し か し な が ら, antibody は, most の ジ ス ル フ ィ ド combining を contains huge む タ ン パ ク qualitative で あ る た め, antibody を intracellular に import し た り で function in the cell さ せ た り す る こ と が で き ず, living cells に お け る タ ン パ ク の Dynamic analytical に は using で き な い. そ こ で, this study で は, antibody に か わ っ て, intracellular へ の import が な possible さ く settle な affinity プ ロ ー ブ を snare of か に つ system for making す る technology を establish す る. す な わ ち, three-dimensional structure モ チ ー フ (alpha ヘ リ ッ ク ス な ど) を も つ ペ プ チ ド の フ ァ ー ジ surface tip ラ イ ブ ラ リ ー し the を cropping systems, construction intelligence に base づ く system な, ラ イ ブ ラ リ ー の choose don't う を line. Three-dimensional structure を hold た せ る こ と に よ り, antibody と with others に, high い specificity と affinity, さ ら に within living cells で の stability を get す る こ と が で き る. (1) alpha ヘ リ ッ ク ス tectonic ペ プ チ ド ラ イ ブ ラ リ ー の constructs: ヘ リ ッ ク ス · ル ー プ · ヘ リ ッ ク ス a す を construction る 35 ア ミ ノ acid residues か ら な る ペ プ チ ド 1 AA の alpha ヘ リ ッ ク ス tectonic の lateral 5 ア ミ ノ acid residues を ラ ン ダ ム change し た ペ プ チ ド ラ イ ブ ラ リ ー を フ ァ ー ジ surface に prompt さ せ, フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ ー を build し た. (2) ヘ リ ッ ク ス · ヘ ヤ ピ ン tectonic ペ プ チ ド ラ イ ブ ラ リ ー の constructs: ヘ リ ッ ク ス · ル ー プ · ヘ リ ッ ク ス a す を construction る ペ Part 1 aa プ チ ド の ル ー プ の ア ミ 5 ノ acid residues を ラ ン ダ ム change し た ペ プ チ ド ラ イ ブ ラ リ ー を フ ァ ー ジ surface に prompt さ せ, フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ ー を build し た. (3) オ ー ロ ラ キ ナ ー ゼ の immobilized conditions の 検 beg: オ ー ロ ラ キ ナ ー ゼ に す seaborne る affinity ペ プ チ ド を get す る に あ た り, フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ ー の choose don't use に す る オ ー ロ ラ A を プ レ ー ト へ immobilized す る conditions を beg し 検 た. IMAP シ ス テ ム を with い て, オ ー ロ ラ A キ ナ ー ゼ の activity を adjustment べ た と こ ろ, グ ル タ チ オ ン プ レ ー ト を with い た immobilized, Anti - GST antibody を with い い た immobilized ず れ の occasions に も キ ナ ー ゼ live Sex されて maintain されて た. Now, these conditions of に よ り immobilized し た オ ー ロ ラ A を use い て affinity ペ プ チ ド の get を beg し 検 て い る.

项目成果

Structural basis of the transition-state stabilization in antibody-catalyzed hydrolysis

抗体催化水解中过渡态稳定的结构基础

• 发表时间: 2007
• 期刊: J. Mol. Biol. 363
• 作者: M.Sakakura;H.Takahashi;N.Shimba;I.Fujii;I.Shimada
• 通讯作者: I.Shimada

Screening of Peptide Antagonists for Cytokine Receptors from Phage-Displayed Libraries

从噬菌体展示文库中筛选细胞因子受体的肽拮抗剂

• 发表时间: 2006
• 期刊: Peptide Science
• 影响因子: 2.4
• 作者: Zengmao Ye;Takeshi Tsumuraya;Daisuke Fuiiwara;Ikuo Fujii
• 通讯作者: Ikuo Fujii

Luciferase Antibody

荧光素酶抗体

• 发表时间: 2006
• 期刊: Peptide Science
• 影响因子: 2.4
• 作者: Takeshi Tsumuraya;Chun Wu;Hideshi Nakamura;Satoshi Inouye;and Ikuo Fujii
• 通讯作者: and Ikuo Fujii

Molecular Mechanisms of Improvement of Hydrolytic Antibody6D9 by Site-Directed Mutagenesis

定点突变改良水解抗体6D9的分子机制

• 发表时间: 2006
• 期刊: J. Biochem. 140
• 作者: Kato;Y.;Oka;N.;Wada;T.;Naoko Takahashi-Ando
• 通讯作者: Naoko Takahashi-Ando

Production of Monoclonal Antibodies for Sandwich Immunoassay Detection of 51-HydroxyCTX3C.

用于 51-HydroxyCTX3C 夹心免疫分析检测的单克隆抗体的生产。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Toxicon 48
• 作者: T.Tsumuraya;et al.
• 通讯作者: et al.