オートファジーによるオルガネラの分解と細胞周期

自噬导致的细胞器降解和细胞周期

基本信息

批准号：
19044016
负责人：
中村暢宏
金额：
$ 4.35万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19044016/
关键词：
ミトコンドリアゴルジ体定量リソソーム酸性化

项目摘要

ミトコンドリア標的シグナル配列を付加したGFPを用いミトコンドリアを標識したCHO細胞を用いて、細胞周期にともなうオートファゴソーム形成の変化をモニターすることを試みた。細胞をノコダゾール処理によって分裂期に同調した後、洗浄して細胞周期を進行させる方法(ノコダゾールブロック)と、過剰量のチミジンを培地に添加してS期に同調した後、洗浄して細胞周期を進行させることを2度行う方法(ダブルチミジンブロック)の両方を試みた。何れの方法でも細胞周期の同調には成功した。しかしながら、ノコダゾールブロックでは、細胞への毒性が強く、細胞周期の再開が良好に起こらず、解析に用いる事ができなかった。一方、ダブルチミジンブロックは、比較的良好に細胞周期の再開が起こった。しかしながら、原因不明の理由によって細胞周期の同調率が低かった。ミトコンドリアのGFP蛍光の増減を測定したところ、多少の変動が観察されたが、再現性のある有意な上昇や下降は残念ながら観察することができなかった。以上の結果から、細胞周期の同調法などに改良を加えてより精度の良い実験系を開発する必要があると考えられた。また、何れの処理によっても薬物の添加を用いることから、薬物の細胞への添加によって細胞の代謝系が活性化し、薬物代謝にかかわるオルガネラであるミトコンドリアに負荷がかかり、ミトコンドリアGFPの変動が副次的に引き起こされた可能性も考えられため、今後は薬物を利用しない細胞周期同調法、例えば、低血清処理による細胞周期同調などを試みる必要性があると考えられた。

我们尝试使用线粒体标记的CHO细胞使用与线粒体目标信号序列的GFP一起监测自噬体形成的变化以及细胞周期。我们尝试了一种方法，其中诺辅唑处理将细胞同步到有丝分裂相，然后洗涤以进行细胞周期（诺科唑块），以及一种将过量胸苷添加到培养基中以同步到S期的方法，然后洗涤以进行细胞周期（双胸腺胺块）。两种方法都成功同步了细胞周期。然而，诺科唑块对细胞具有很强的毒性，并且细胞周期不会恢复，因此无法用于分析。另一方面，双胸腺定阻滞经历了相对较好的细胞周期恢复。但是，由于未知原因，细胞周期同步速率较低。当测量线粒体GFP荧光的增加或减少时，观察到一些变化，但不幸的是，无法观察到可重复可重复的显着上升或下降。基于上述结果，人们认为有必要改善细胞周期调整方法以开发更准确的实验系统。此外，由于在任何一种治疗中都使用了药物的添加，因此在细胞中添加药物会激活细胞的代谢，使线粒体负担负担，这是一种参与药物代谢的细胞器，从而导致二次诱导的线粒体GFP中二次诱导的波动。因此，人们认为有必要在没有药物的情况下尝试细胞周期调整，例如通过低血清治疗进行细胞周期调整。