感染病態形成におけるフリーラジカル病因論に関する研究

传染病发病机制中自由基发病机制的研究

基本信息

批准号：
15019084
负责人：
赤池孝章
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15019084/
关键词：
感染病態フリーラジカル病因論 NO 8-ニトログアノシン遺伝子変異

项目摘要

本年度は、感染病態におけるNOによる核酸ニトロ化反応に焦点をあて解析を行った。すなわち、NOによる修飾塩基である8-ニトログアノシンの単クローン抗体を作成し、インフルエンザウイルス感染モデルや各種培養細胞における8-ニトログアノシン生成を検討した。さらに、8-ニトログアノシンによるウイルス遺伝子変異誘発、および、新規の細胞内シグナル伝達機構について解析を行った。その結果以下の知見を得た。(1)8-ニトログアノシンの大量有機合成法を確立し、抗8-ニトログアノシン抗体(多クローンおよび単クローン)を作成した。本抗体を用いて、マウスインフルエンザウイルス肺炎モデルにおける、8-ニトログアノシンの生体内生成を免疫組織化学的に解析した。その結果、インフルエンザウイルス感染マウスの肺組織において、誘導型NO合成酵素(iNOS)の発現に伴って、主に、気管支・細気管支上皮細胞の細胞質内に、8-ニトログアノシンが産生されることが分かった。よって、ウイルス感染病態におけるNO生成に依存した新規修飾塩基8-ニトログアノシンの生体内生成を初めて証明できた。さらに、抗8-ニトログアノシン抗体を用いたELISAを確立し、各種培養細胞における8-ニトログアノシン生成を定量的に解析したところ、生理的な濃度のNOにより、細胞内に8-ニトログアノシンが効率よく生成することが明かとなった。(2)組換えGFP-センダイウイルス(SeV)感染CV-1細胞を8-ニトログアノシンにより処理して、ウイルスのRNAゲノムの変異頻度に与える影響を検討したところ、NOと同様に、8-ニトログアノシンが遣伝子変異促進作用を発揮した。さらに、CV-1細胞培養系において、8-ニトログアノシンにより誘発されるウイルスGFP遺伝子の変異スペクトラムは、マウス感染モデルにおいてGFP-SeV感染肺組織より分離されるウイルスのGFPゲノム変異のパターンと比較的類似していた。従って、NOが8-ニトログアノシン生成を介してウイルス変異を加速することが示唆された。(3)NO生成を介して産生される8-ニトログアノシンは、ユニークな化学的反応性(レドックス活性)を有していることも分かってきた。すなわち、8-ニトログアノシンは、生体内に豊富に存在するNADPH依存性還元酵素、例えば、P450 reductaseやiNOSを含めたすべてのNOSアイソフォーム(血管型eNOS,神経型nNOS)により活性化され、活性酸素産生をもたらすことが明らかになった。さらに興味あることに、NO産生に依存して細胞内に生成する8-ニトログアノシンは、細胞のヘムオキシゲナーゼ-1の発現誘導を介して強い細胞保護作用を示した。よって、宿主細胞の生存シグナルにNO・8-ニトログアノシンによる新たなシグナル伝達経路が存在することが示唆された。以上より、感染病巣において過剰に産生されるNOが、病原細菌に抗菌作用を発揮するだけでなく、8-ニトログアノシン生成を介して、ウイルスの分子進化に関与したり、宿主の生存シグナルを制御することにより、感染防御と病態発現に深く関わることが分かってきた。

今年，在传染病状态下NO进行了分析，重点是核酸硝化的反应。换句话说，制备了8-硝基瓜氨氨酸的单克隆抗体，并制备了NO的改良碱，并在流感病毒感染模型和各种培养细胞中研究了8-硝基瓜氨酸。此外，我们通过8-亚硝基氨氨酸和新型细胞内信号传导机制分析了病毒基因诱变。结果，获得了以下发现。（1）建立了8-硝基瓜氨酸的大规模有机合成，并制备了抗8-硝基瓜氨酸抗体（Multiclones和Monoclones）。使用这种抗体，对小鼠流感病毒肺炎模型中8-硝基瓜氨酸的体内产生进行了免疫组织化学分析。结果，发现8-硝基瓜氨糖苷主要在流感病毒感染的小鼠的肺组织中支气管和支气管上皮细胞的细胞质中产生，并表达诱导的无合酶（Inos）。因此，有可能首次证明体内生产新型改良的基础8-硝基瓜氨酸，这取决于没有体内病理学的产生。此外，还建立了使用抗8-硝基瓜氨酸抗体的ELISA，并对各种培养的细胞中的8-硝基瓜氨酸产生的定量分析表明，在具有NO的生理浓度的细胞中，有效地生产了8-硝基瓜氨酸。（2）当用8-硝基瓜氨氨酸处理重组GFP-Sendaivirus（SEV）感染的CV-1细胞时，检查了该病毒RNA基因组中突变的作用，类似于NO，类似于NO，8-硝基瓜氨基氨氨酸，施加了pro-Transmptit效应。此外，在CV-1细胞培养系统中，由8-硝基瓜氨酸诱导的病毒GFP基因的突变光谱与在小鼠感染模型中从GFP-SEV感染的肺组织中分离出的病毒中GFP基因组突变的模式相对相似。因此，有人提出，没有通过8-硝基瓜氨酸的产生加速病毒突变。（3）还发现，通过NO生产产生的8-硝基瓜氨酸具有独特的化学反应性（氧化还原活性）。也就是说，所有NOS同工型（血管eNOS，神经NNOS）都激活了8-硝基瓜氨酸，包括体内丰富的NADPH依赖性还原酶，例如P450还原酶和iNOS，导致活性氧产生活性。更有趣的是，8-硝基瓜氨氨酸是根据没有产生的细胞内产生的，它通过诱导细胞血红素氧酶-1表达而表现出强大的细胞保护作用。这表明在宿主细胞的存活信号中存在8号硝基瓜氨酸的新信号通路。从上面的角度来看，已经发现，在感染性病变中过度产生的NO不仅在致病性细菌上施加抗菌特性，而且还通过参与8-硝基糖苷和控制宿主宿主生存信号的产生，通过参与病毒的分子进化而深深地参与感染保护和病理发育。