グルタミン酸受容体のリン酸化と神経回路形成の分子生物学的研究

谷氨酸受体磷酸化和神经回路形成的分子生物学研究

基本信息

批准号：
15029258
负责人：
中井淳一
金额：
$ 4.22万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15029258/
关键词：
グルタミン酸受容体神経活動 LTP GFP リン酸化神経回路興奮性シナプス

项目摘要

グルタミン酸受容体は興奮性神経伝達に関与し、シナプスの長期増強(LTP)のメカニズムとしてAMPA型グルタミン酸受容体のリン酸化により膜への受容体の組み込みやチャネル活性の増加が関与しているという報告がある。また脱リン酸化によるLTDも報告されている。この研究ではAMPA型グルタミン酸受容体のリン酸化を可視化するための蛍光センサーを試作し、試作したセンサーを用いてグルタミン酸受容体の活動を時間的空間的に捉え、神経回路に及ぼす作用を明らかにすることを目的とする。AMPA型グルタミン酸受容体のC末端の細胞内領域に存在するカルシウムカルモジュリン依存性キナーゼII (CaMKII)およびAキナーゼによりリン酸化部位を含むアミノ酸配列の前後に、GFPの変異体であるYFPおよびCFPを付加した蛍光センサー分子のcDNAを試作した。試作したセンサーの機能を調べるため、センサーcDNAをHEK293細胞に発現させ、リン酸化を即す刺激により蛍光変化を測定した。Aキナーゼを活性化するForskolinおよびdibutyryl cAMPによる刺激ではYFP/CFPの蛍光比の微弱な増加が観測された。またCaMKIIを刺激するためIonomycinを投与した結果、明らかなYFP/CFPの蛍光比の増加が観測された。今回、グルタミン酸受容体のリン酸化のFRETを用いた蛍光センサーを作成した。リン酸化刺激により蛍光変化が観察された。しかし、その程度は小さく、実用的には検出感度の点でまだ厳しく、神経回路の検討にまでは至れなかった。

谷氨酸受体参与兴奋性神经传递，并有报道称，AMPA型谷氨酸受体的磷酸化参与膜整合，并增加通道活性，作为长期突触增强（LTP）的机制。去磷酸化诱导的有限公司也有报道。这项研究旨在创建一个荧光传感器，以可视化AMPA型谷氨酸受体的磷酸化，并使用原型传感器在时间和空间上捕获谷氨酸受体的活性，从而揭示对神经回路的影响。我们已经在氨基酸序列前后，由钙钙调蛋白依赖性激酶II（CAMKII）和含量的c-termarular区域中存在于Ampaa-ppa-termanus的c-termarular区域中，含磷酸化位点的氨基酸序列前后创建了荧光传感器分子的cDNA，它们是GFP的突变体，它们是GFP的突变体，它们是氨基酸序列含有磷酸化位点的cDNA。为了研究原型传感器的功能，在HEK293细胞中表达了传感器cDNA，并通过适应磷酸化的刺激来测量荧光变化。当用Forskolin和dibutyryl CAMP刺激激酶时，观察到YFP/CFP的荧光比略有增加。此外，由于给药刺激CAMKII，观察到YFP/CFP的荧光比明显增加。在本文中，我们使用FRET创建了一个用于谷氨酸受体磷酸化的荧光传感器。磷酸化刺激时观察到荧光变化。但是，它的程度很小，而且实际上它仍然是严格的，就检测敏感性而言，不可能研究神经回路。