蛋白性蛍光センサープローブによるショウジョウバエ脳の情報処理経路の研究

使用基于蛋白质的荧光传感器探针研究果蝇大脑中的信息处理途径

• 批准号: 12048227
• 负责人: 中井 淳一
• 金额: $ 3.65万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12048227/
• 关键词: GFP; ショウジョウバエ; カルシウム; バイオセンサー

本研究はGreen Fluorescent Protein(GFP)を用いてカルシウムイオンを持つプローブを開発し、ショウジョウバエの脳に発現させて臭覚系および味覚系の神経回路の同定とその情報処理の過程を明らかにすることを目標とする。GFPにカルモジュリンとそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼのM13配列をfusionさせることによりカルシウムイオンに対する蛋白性蛍光プローブの作成を行った。このプローブは1波長励起(489nm)1波長測光(509nm)のプローブであり、その蛍光変化量が最大で4.5と大きいため、この遺伝子を筋肉細胞に発現させたとき顕微鏡を通して肉眼的にもその蛍光の変化を観察できるほどであった。このプローブに関して特許を申請した。G-CaMPには温度感受性があるため、培養細胞に発現させ37度で培養したとき蛍光団を形成できないという問題があった。この点を改良するために蛋白質のfoldingを安定化することが知られている点突然変異をG-CaMPに導入して新たにG-CaMP1.6を作成した。G-CaMP1.6は残念ながら37度では蛍光団を形成できなかったが、28度で蛍光団を形成しモル吸光係数、量子収率ともにG-CaMPより大きな値を示した。その結果G-CaMP1.6はG-CaMPに比較して約40倍明るいことが明らかとなった。またG-CaMP1.6は蛍光団を形成する速さが速く、その時定数は約22分で、G-CaMPの時定数に比べて約3倍速くなっていた。G-CaMP1.6のKdは146nM,Hill係数は3.8,最大蛍光変化量は4.9であった。現在G-CaMPおよびG-CaMP1.6をショウジョウバエ等の動物に発現させin vivoでの測定を行いつつある。

This study は Green Fluorescent Protein (GFP) を い て カ ル シ ウ ム イ オ ン を hold つ プ ロ ー ブ を open 発 し, シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ の 脳 に 発 now さ せ て smelly 覚 department お よ び flavour 覚 is の の 経 circuit with god or と そ の intelligence 処 Richard の process を Ming ら か に す る こ と を target と す る. GFP に カ ル モ ジ ュ リ ン と そ れ に combining す る ミ オ シ ン 軽 lock キ ナ ー ゼ の M13 match column を fusion さ せ る こ と に よ り カ ル シ ウ ム イ オ ン に す seaborne る protein 蛍 optical プ ロ ー ブ の made line を っ た. こ の プ ロ ー ブ は 1 wavelength wound up (489 nm) wavelength photometric (509 nm) の プ ロ ー ブ で あ り, そ の 蛍 light - the maximum amount が で 4.5 と large き い た め, こ の posthumous son 伝 を brawn cells に 発 now さ せ た と き 顕 micromirror を tong し て eye に も そ の 蛍 の light - the を 観 examine で き る ほ ど で あ っ た. Youdaoplaceholder2 プロ プロ ブに ブに application for <s:1> て charter を application た た. G - CaMP に は temperature sensitivity が あ る た め, culture cell に 発 now さ せ 37 degrees で cultivate し た と き 蛍 light 団 を form で き な い と い う problem が あ っ た. こ の point を improved す る た め の に protein folding を stabilization す る こ と が know ら れ て い る point suddenly - different を G - CaMP に import し て new た に G - CaMP1.6 を made し た. G - CaMP1.6 は remnants read aloud な が ら 37 degrees で は 蛍 light 団 を form で き な か っ た が, 28 degrees で 蛍 light 団 を form し モ ル rate of absorption coefficient, quantum 収 と も に G - CaMP よ り big き な numerical を shown し た. Youdaoplaceholder0 そ the result is that G-CaMP1.6 g-camp に is about 40 times clearer than <s:1> て る となった とが とが ら となった となった. ま た G - CaMP1.6 は 蛍 light 団 を form す る speed さ が く and そ の when destiny は で about 22 points, G - CaMP の when destiny に than べ て about 3 times the speed く な っ て い た. G-camp 1.6 <s:1> Kd <s:1> 146nM,Hill coefficient <e:1> 3.8, maximum 蛍 light variation <e:1> 4.9であった. Now G - CaMP お よ び G - CaMP1.6 を シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ の animals such as に 発 now さ せ in vivo で の line measurement を い つ つ あ る.

项目成果

Proenza C, O'Brien J, Nakai J, Mukherjee S, Allen PD, Beam KG.: "Identification of a region of RyR1 that participates in allosteric coupling with the alpha(1S) (Ca(V)1.1) II-III loop"J. Biol. Chem.. 277. 6530-6535 (2002)

Proenza C、OBrien J、Nakai J、Mukherjee S、Allen PD、Beam KG.：“鉴定参与与 alpha(1S) (Ca(V)1.1) II-III 环变构偶联的 RyR1 区域