蛋白性蛍光センサープローブによるショウジョウバエ脳の情報処理経路の研究

使用基于蛋白质的荧光传感器探针研究果蝇大脑中的信息处理途径

基本信息

批准号：
12048227
负责人：
中井淳一
金额：
$ 3.65万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12048227/
关键词：
GFP ショウジョウバエカルシウムバイオセンサー

项目摘要

本研究はGreen Fluorescent Protein(GFP)を用いてカルシウムイオンを持つプローブを開発し、ショウジョウバエの脳に発現させて臭覚系および味覚系の神経回路の同定とその情報処理の過程を明らかにすることを目標とする。GFPにカルモジュリンとそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼのM13配列をfusionさせることによりカルシウムイオンに対する蛋白性蛍光プローブの作成を行った。このプローブは1波長励起(489nm)1波長測光(509nm)のプローブであり、その蛍光変化量が最大で4.5と大きいため、この遺伝子を筋肉細胞に発現させたとき顕微鏡を通して肉眼的にもその蛍光の変化を観察できるほどであった。このプローブに関して特許を申請した。G-CaMPには温度感受性があるため、培養細胞に発現させ37度で培養したとき蛍光団を形成できないという問題があった。この点を改良するために蛋白質のfoldingを安定化することが知られている点突然変異をG-CaMPに導入して新たにG-CaMP1.6を作成した。G-CaMP1.6は残念ながら37度では蛍光団を形成できなかったが、28度で蛍光団を形成しモル吸光係数、量子収率ともにG-CaMPより大きな値を示した。その結果G-CaMP1.6はG-CaMPに比較して約40倍明るいことが明らかとなった。またG-CaMP1.6は蛍光団を形成する速さが速く、その時定数は約22分で、G-CaMPの時定数に比べて約3倍速くなっていた。G-CaMP1.6のKdは146nM,Hill係数は3.8,最大蛍光変化量は4.9であった。現在G-CaMPおよびG-CaMP1.6をショウジョウバエ等の動物に発現させin vivoでの測定を行いつつある。

这项研究旨在使用绿色荧光蛋白（GFP）开发钙离子的探针，并在果蝇的大脑中表达探针，以鉴定气味和味觉系统中的神经回路并阐明信息处理过程。钙离子的蛋白质荧光探针是通过将其与GFP结合的M13序列和肌球蛋白轻链激酶融合来制备的。该探针是1波长的激发（489 nm）和一个波长的光度法（509 nm）探针，荧光变化最多为4.5，因此当在肌肉细胞中表达该基因时，可以通过显微镜在视觉上观察荧光变化。该探针已提交专利。由于G-cAMP对温度敏感，因此存在一个问题，即在培养的细胞中表达并在37°C培养时无法形成荧光团。为了改善这一点，将已知稳定蛋白质折叠的点突变引入G-camp中，以创建新的G-camp1.6。不幸的是，G-camp1.6不能在37°下形成荧光团，但在28°时形成荧光团，在摩尔灭绝系数和量子产率中显示出比G-camp大的值。结果表明，G-camp1.6比G-camp亮40倍。此外，G-camp1.6形成荧光团的速度更快，时间常数约为22分钟，比g-camp时间常数快三倍。 G-camp1.6的KD为146 nm，山系数为3.8，最大荧光变化为4.9。目前，G-camp和g-camp1.6在果蝇等动物中表达，并在体内进行测量。