興奮収縮連関におけるリアノジン受容体の構造と機能の研究

兰尼碱受体兴奋-收缩耦合结构与功能研究

基本信息

批准号：
09257244
负责人：
中井淳一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

骨格筋において細胞膜の電位依存性L型カルシウムチャネル(ジヒドロピリジン受容体、DHPR)と筋小胞体のリアノジン受容体は興奮収縮連関の中心的機能を果たしている。この2つの分子は蛋白どうしが結合して情報伝達を行っていると考えられているが、その分子機構は明らかになっていない。先に我々は骨格筋型リアノジン受容体(RyR-1)はDHPRと相互に作用しあうが、心筋型リアノジン受容体(RyR-2)はDHPRと相互に作用しないことを見い出した。この実験の目的はRyR-1とRyR-2のこの機能の差に着目し、分子生物学的方法を用いて興奮収縮連関におけるリアノジン受容体とDHPRの相互の活性化機構を明らかにすることである。実験方法:RyR-1とRyR-2のキメラcDNAを作製し、RyR-1遺伝子を欠くdyspedic mouseの培養骨格筋細胞に発現させた。パッチクランプ法と蛍光カルシウム測定法によりカルシウム電流とカルシウム放出をそれぞれ測定した。その結果、foot領域にRyR-1のアミノ酸配列を含むキメラR1を発現させた細胞では骨格筋型の興奮収縮連関もカルシウムチャネルの機能もどちらも回復していた。次にキメラのRyR-1の領域をさらに狭めていき、最終的に1635-2636番目のアミノ酸にのみRyR-1の配列を含むキメラR10を発現させた。このR10を発現させた細胞は骨格筋型の興奮収縮連関もカルシウムチャネルの機能もどちらも回復していた。また、RyR-1(2689-3720)のアミノ酸配列を含むキメラR9を発現させた細胞ではカルシウムチャネルの機能の回復のみを認め、骨格筋型の興奮収縮連関の回復は認めなかった。以上の結果から、L型カルシウムチャネルとリアノジン受容体(RyR-1)との蛋白蛋白相互作用がRyR-1のfoot領域を介して行われることが明らかになった。さらにリアノジン受容体の少なくとも2カ所の異なる部位がこの相互作用に関係することが明らかとなった。

骨骼肌在骨骼肌中的细胞膜（二氢吡啶受体，DHPR）和ryanodine受体的电压依赖性L型钙通道在激发和收缩链接中起着核心功能。据认为，蛋白质彼此结合以传输信息，但是这两个分子的分子机制尚不清楚。以前，我们发现骨骼肌ryanodine受体（RYR-1）与DHPR相互作用，而心肌ryanodine受体（RYR-2）不与DHPR相互作用。该实验的目的是专注于RYR-1和RYR-2之间的功能差异，并使用分子生物学方法来阐明Ryanodine受体的相互激活机制和DHPR在激发和收缩联系中。实验方法：在缺乏RYR-1基因的蛋白质小鼠的培养骨骼肌细胞中制备RYR-1和RYR-2的嵌合cDNA。分别使用贴片夹和荧光钙测量测量钙电流和钙释放。结果，恢复了骨骼肌类型的激发和收缩连接的嵌合R1的嵌合R1的细胞以及钙通道的功能。然后进一步缩小嵌合中的RYR-1区域，最后，仅在氨基酸1635-2636处表达包含RYR-1序列的嵌合R10。表达R10的细胞恢复了骨骼肌型激发和收缩连接以及钙通道的功能。此外，表达嵌合含有RYR-1的氨基酸序列（2689-3720）的嵌合R9的细胞仅恢复了钙通道的功能，并且没有恢复骨骼肌型激发和收缩连接。以上结果表明，L型钙通道与瑞氨烷受体（RYR-1）之间的蛋白质蛋白质相互作用通过RYR-1的脚区域发生。还揭示了至少两个不同的位点ryanodine受体参与这种相互作用。