試験管内遺伝子発現系を用いたタンパク質の機能発現プロセスの研究

利用体外基因表达系统研究蛋白质功能表达过程

• 批准号: 15032210
• 负责人: 上田 卓也
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15032210/
• 关键词: シャペロン; 抗体; 生体外蛋白質合成系; 凝集; フォールディング

特定領域研究(2)(試験管内遺伝子発現系を用いたタンパク質の機能発現プロセスの研究)私達は、大腸菌の翻訳因子やリボソームを完全に精製し、再構築したPURE(Protein synthesizing system Using Recombinant Elements)システムを完成させることに成功している。PUREシステムによって翻訳のすべてのプロセスを、試験管のなかで行うことが可能であるばかりではなく、すべてのプロセスのスナップショットを取ることが可能である。本研究では、PUREシステムを用いて、翻訳過程と蛋白質のフォールディングのプロセスがいかに共同的に働いているかを検討した。大腸菌において、新生ペプチドがリボソーム上で合成される場合、トリッガーファクター、DnaK、DnaJ、GrpE、GroELが関与してフォールディングが進行するとする説が提唱されている。まず、PUREシステムで合成したscFv蛋白質は、通常の抽出液を用いたものに比べ,凝集が低く押さえられることを見いだした。私達は、抗体の一部であるscFvを、PUREシステムを用いてこれらのシャペロン存在下で蛋白質の合成を行った。その結果、DnaK,GrpE存在下において凝集する蛋白質の比率が低下し、またフォールングが促進されることが、確認された。また、GroEL/ESが、翻訳と共同している可能性も示唆された。また、Apg2などの真核生物由来のシャペロンも高効率で凝集を防ぐことが示された。また、ディスルフィド結合を促進するPDIが酸化的な環境でscFVの活性を向上させることを見いだした。同時に膜蛋白質の合成系も確立し、SecBによる凝集の防止が、分泌には必須であるごとが明らかとなった。

Specific field research (2)(Study on functional development of protein in vitro using Recombinant Elements) Complete purification and reconstruction of Protein synthesis system Using recombinant elements for E. coli and E. coli. PURE STEM: The test tube can be used to test the potential of the PURE STEM. In this study, we investigated the use of Purestone and protein in the process of protein transformation. Coliform bacteria, new bacteria, bacteria, bacteria The scFv protein was synthesized in the presence of PURE, and the aggregation was lower than that of the normal extract. Part of the antibody is scFv, PURE and protein synthesis. The results showed that the protein aggregation ratio was decreased in the presence of DnaK and GrpE, and the protein aggregation was promoted. GroEL/ES is the most common way to improve the quality of your products. In addition, Apg2 ́ s eukaryote-derived membrane is highly efficient and can prevent agglutination. The activity of scFV in the acidified environment is promoted by PDI. At the same time, the synthesis of membrane proteins is established, and the aggregation is prevented.

项目成果

B.Ying, T.Suzuki, T.Shimizu, T.Ueda: "A novel screening system for self-mRNA targeting proteins"J. of Biochem. (In press). (2003)

B.Ying，T.Suzuki，T.Shimizu，T.Ueda：“一种新型的自我 mRNA 靶向蛋白筛选系统”J。