RNAをターゲティングする蛋白質の検索システムのデザイン

针对RNA的蛋白质搜索系统的设计

• 批准号: 12019208
• 负责人: 上田 卓也
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12019208/
• 关键词: 分子進化系; 蛋白質合成系; リボソーム蛋白質; 翻訳制御

遺伝情報発現の転写レベルでの制御の全容が、真核生物を中心として明らかになりつつあるが、翻訳レベルでの制御機構に関しては、その解明はいまだ十分とは言い難い。翻訳段階での制御は、転写とは異なり、短時間かつデリケートに行えるために、利点が多いと考えられ,今後多様な制御機構が明らかにされるものと予想される。本研究では、RNAに結合能を持つ蛋白質を、スクリーニングするシステムを構築することにより、翻訳レベルでの制御機構の全体像に迫ることに挑戦する。すでに大腸菌の精製した必須な成分から再構築した無細胞翻訳系(PURE SYSTEM)の開発に成功している。このPURE SYSTEMには、蛋白質やRNAなどを分解する成分が含まれないことから、今後ポリソームディスプレー法の主流となるものと期待されている。本研究ではPUREシステムを翻訳制御の研究における中心的なスクリーニングの系として確立することを目的とする。まず,PURE SYSTEMにより、cDNAのラブラリーから、蛋白質を合成させ、新生ペプチドの中から、mRNAに結合能を持つものを選抜する。あらかじめcDNAには、タグ配列を挿入しておき、このタグを利用して、ペプチドと結合したmRNAを選抜し、RT-PCR、PCRにより増幅する。このサイクルを繰り返すことで、自らのmRNAに結合する蛋白質の遺伝子のみが濃縮されていく。このことにより特異的なRNA-蛋白質相互作用をとらえることが可能となると期待される。自らのmRNAに結合することがすでに知られている大腸菌リボソーム蛋白質S15を用いて、本システムの有効性を検討した。S15のmRNAの5'に存在するS15結合部位であるシュウドノット構造を形成できない変異型と、天然型の遺伝子をT7-tagと融合したものを作製した。この両者のmRNAを共存させたサンプルをPUREシステムで翻訳させ、合成された蛋白質に結合するmRNAをT7抗体により回収した。その結果、変異型に比べて天然型のRNAが優先的に選抜されていることが示された。現在この濃縮効率の向上を検討しているが、本システムが自らmRNAの結合するペプチドを選抜するのに有効なことが示された。

The control mechanism of genetic information generation is completely contained, eukaryotic organisms are at the center of the development process, and the control mechanism of genetic information generation is related to the development process. In the future, there will be many kinds of control institutions, such as the control system, the control system, the control system and the control system. In this study, RNA binding energy was used to support protein, protein and protein expression. The purification of E. coli and the reconstruction of its essential components have led to the successful development of a cell-free PURE SYSTEM. The PURE SYSTEM is composed of protein and RNA components. This study aims to establish a system for controlling the development of the Pureform system. PURE SYSTEM, cDNA, protein synthesis, nascent selection, mRNA binding and selection cDNA sequencing, mRNA selection, RT-PCR and PCR amplification The expression of protein is concentrated in the mRNA binding region. The RNA-protein interaction is specific. Since the mRNA binding, the expression of protein S15 in E. coli has been studied. S15 mRNA is present at the 5'end of the S15 binding site, and the structure of the S15 binding site is controlled by T7-tag fusion. The mRNA of this protein is co-located with T7 antibody. As a result, heteromorphic RNA is preferred over native RNA. Now the concentration rate is up to 100%, and the gene expression is up to 100%, which is up to 100%.

项目成果

Yasukawa,T: ""Modification Defect at Anticodon Wobble Nucleotide of Mitochondrial tRNAs^<Leu>(UUR) with Pathogenic Mutation of Mitochondrial Myopathy, Encephalopahty, Lactic Acidosis, and Stroke-like Episodes""J.Biol.Chem.. 275. 4251-4257 (2000)

Yasukawa，T：“线粒体 tRNA 反密码子摆动核苷酸的修饰缺陷^ <Leu>（UUR）与线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和中风样发作的致病性突变”“J.Biol.Chem.. 275。

Yokogawa, T.: "Characterization and tRNA Recognition of Mammalian Mitochondrial Seryl-tRNA Synthetase"J. Biol. Chem.. 275. 19913-19920 (2000)

横河，T.：“哺乳动物线粒体 Seryl-tRNA 合成酶的表征和 tRNA 识别”J。

Tasukawa,T: ""Defect in modification at the anticodon wobble nucleotide of mitochondrial tRNA^<Lys> with the MERRF encephalomyopathy pathogenic mutation""FEBS Letters. 467. 175-178 (2000)

Tasukawa,T：“线粒体 tRNA^<Lys> 的反密码子摆动核苷酸修饰缺陷，具有 MERRF 脑肌病致病性突变””FEBS Letters。

Yasukawa, T: "A pathogenic point mutation reduces stability of mitochondrial mutant tRNA^<lle>"Nucleic Acids Research. 28. 3779-3784 (2000)

Yasukawa, T：“致病性点突变降低了线粒体突变 tRNA^<lle> 的稳定性”核酸研究。

Tomari, Y: "The role of tightly bound ATP In Escherichia coli tRNA nucleotidyltransferase"Genes to Cells. 5. 689-698 (2000)

Tomari, Y：“紧密结合的 ATP 在大肠杆菌 tRNA 核苷酸转移酶中的作用”基因到细胞。