セルフリーイムノロジーによる人工抗体作製法の開発

利用无细胞免疫学开发人工抗体生产方法

• 批准号: 18038006
• 负责人: 上田 卓也
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18038006/
• 关键词: 生体外蛋白質合成系; 進化工学; 蛋白質相互作用; リボソーム; 終結因子; 抗体

リボソームディスプレー法(RD法)を行う場合、リボソーム三者複合体の形成効率が極めて重要なポイントとなる。そこでまず、形成効率に影響するC末端側コンストラクトの検討を行った。HyHEL10scFv(リゾチーム特異的抗体)の下流に、リボソーム内部で翻訳アレストを起こすと報告されているSecMのアレスト配列を導入することで、RDにおけるmRNAの効率が上昇するという新しい知見を得るに至った。これはSecM導入によるリボソーム複合体の形成効率向上によるものであると考えられ、特にPURESYSTEMではSecMのストールを不安定化するtmRNAなどが存在しないため有効な方法であると推測された。また、PURESYSTEMは因子の有無など環境を自由に設計できるため、これまでの細胞抽出系を用いた場合では不可能であったシステムの詳細な素過程解析を行うことが可能である。「mRNA-リボソーム-蛋白質複合体」の形成に必須な各因子(EF、リボソーム、mRNA)をRD系中から出し入れし、HyHEL10とDHFRとの1:30からのセレクション(リガンドとしてリゾチームを使用)を行ったところ全ての因子が存在する場合にのみ、HyHEL10の特異的選択がみられ、「mRNA-リボソーム-蛋白質複合体による目的分子の特異的選択」というRD法の基本概念を、PURESYSTEMを用いることで実験的に確認することが出来た。さらに、scFvの特異的選択系において、細胞抽出液の無細胞蛋白質合成系を用いた場合よりもPURESYSTEMを用いた場合の方が、高効率に選択されることを実験的に確認した。また、本方法では1ラウンドのセレクションにおいて、目的分子を12000倍以上に濃縮できることを確認した。これまで報告されているRD法では1000倍以下の濃縮効率である。さらに、プールとして、10^<10>から10^<11>倍の非結合性のタンパク質遺伝芋で希釈しても、目的の抗体遺伝子が、3回から5回の選抜で単離可能なことがしめされ、これは本方法の有効性を示すものであると考えられる。さらに、抗原の固定について、PURE systemを用いて非天然アミノ酸を導入して効率よく固定する手法を開発した。

The formation rate of the three-component complex is extremely important in the case of the RD method. C terminal side of C terminal side HyHEL10scFv(a specific antibody) was reported to have increased mRNA expression in the downstream, downstream and downstream regions. The formation efficiency of the complex is higher than that of the pure STEM. PURESYSTEM is a cell extraction system that can be used in situations where it is not possible to analyze the detailed process of cell extraction. The factors (EF, mRNA, and mRNA) required for the formation of mRNA-protein complexes are introduced into the RD system, HyHEL10 and DHFR are used at 1:30, and the specific selection of HyHEL10 and the specific selection of target molecules in mRNA-protein complexes are confirmed in the basic concepts of RD method and PURESYSTEM. In addition, scFv specific selection system, cell extract and cell-free protein synthesis system were used in the case of PURESYSTEM, and the method of high efficiency selection was confirmed. The method can be used to concentrate target molecules by more than 12000 times. The RD method has a concentration ratio of less than 1000 times. In addition, 10^-<10>10^<11>-fold non-binding protein is expected to be present in the target antibody gene, 3 - 5 cycles of selection, and 3 - 5 cycles of selection. In addition, for the immobilization of antigens, a PURE system was developed to introduce unnatural amino acids and immobilize them efficiently.

项目成果

Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2006.11.017
• 发表时间: 2007-01-05
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: Ohashi, Hiroyuki;Shimizu, Yoshihiro;Ueda, Takuya
• 通讯作者: Ueda, Takuya

Chaperone properties of mammalian mitochondrial translation elongation factor Tu

• DOI: 10.1074/jbc.m608187200
• 发表时间: 2007-02-09
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Suzuki, Hiroaki;Ueda, Takuya;Takeuchi, Nono
• 通讯作者: Takeuchi, Nono

Spermidine inhibits transient and stable ribosome subunit dissociation

• DOI: 10.1016/j.febslet.2006.01.033
• 发表时间: 2006-02-01
• 期刊: FEBS LETTERS
• 影响因子: 3.5
• 作者: Umekage, S;Ueda, T
• 通讯作者: Ueda, T

SmpB triggers GTP hydrolysis of elongation factor Tu on ribosomes by compensating for the lack of codon-anticodon interaction during trans- translation initiation

• DOI: 10.1074/jbc.m512165200
• 发表时间: 2006-06-09
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Shimizu, Yoshihiro;Ueda, Takuya
• 通讯作者: Ueda, Takuya

Ribosomal protein S1 is not essential for the trans-translation machinery

• DOI: 10.1016/j.jmb.2007.02.068
• 发表时间: 2007-05-04
• 期刊: JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.6
• 作者: Qi, Hao;Shimizu, Yoshihiro;Ueda, Takuya
• 通讯作者: Ueda, Takuya