Biochemische Charakterisierung des pIP501-kodierten Transkriptionsrepressors CopR und Evolution des CopR-targets

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Der Transkriptionsrepressor CopR (92 aa, 10.6 kD) ist einer der beiden Regulatoren der Replikation des Streptokokkenplasmids pIP501. CopR reprimiert die Transkription der essentiellen repR-mRNA ca. 10-20fach und verhindert die konvergente Transkription von Sense- und Antisense-RNA. CopR bindet asymmetrisch als vorgeformtes Dimer an zwei Bindungsorten in der großen Furche der DNA. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten für die CopR-Dimere und den CopR-DNA-Komplex sowie die intrazelluläre Konzentration in B. subtilis wurden bestimmt. Ein 3D-Strukturmodell der ersten 63 Aminosäuren von CopR wurde konstruiert und zur Lokalisation des DNA-Bindungsmotives/Identifizierung von Aminosäuren, die an der spezifischen und unspezifischen Erkennung der DNA beteiligt sind, sowie zur Grobeingrenzung der Dimerisierungsregion verwendet. Eine Funktion des CopR-C-Terminus ist der Schutz vor Proteolyse. Im Rahmen des geplanten Vorhabens sollen 1) die Evolution des CopR-`targets`mittels SELEX-Verfahren untersucht 2) der Repressionsmechanismus von CopR aufgeklärt, 3) die Konformationsveränderung von DNA und CopR bei Bindung von CopR an seinen Operator untersucht 4) weitere Funktionen des sauren C-Terminus von CopR aufgeklärt und 5) der individuelle Beitrag hydrophober Aminosäuren an der Dimerisierung von CopR bestimmt werden.