Entwicklung eines automatisierten, zeitaufgelösten High-throughput-Screening Assays zur Quantifizierung von Transkriptionsraten in vitro

我的 Rahmen des von der DFG geförderten Projekts wurde ein auf Reporter-Ribozymen basierendes Verfahren entwickelt，最好在体外进行转录激活。 Die prinzipielle Anwendbarkeit des Verfahrens wurde insidehalbdieses Jahres gezeigt und publiziert [A. Jenne、W. Gmelin、N. Raffler、M. Famulok、Angew。化学。国际。埃德。 38（1999），13001303]。报告系统的基本原理是“高通量筛选 (HTS) 检测”，可自动识别转录抑制和激活。 Desweiteren soll das Verfahren angewandt werden，um Mechanismen der pro- und eukaryontischen Transkription (z.B. den Einfluß von Improvern) zu untersuchen。最好的检测方法是使用核酶编码 DNA 载体和寡核苷酸底物，以核酶编码方式进行检测。 Bei Spaltung des FRET-markierten Substrats (FRET = Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) durch das Reporter-Ribozym, wird ein Fluoreszenz-Signal erzeugt, das der Menge an transkribiertem Ribozym 比例ist。荧光测量的测量结果是在非放射性物质的作用下进行非放射性量化的。您可以使用Repaortersystem Substanzen und natürliche Interaktoren aus großen Substanzbibliotheken identifizieren，以及Transkription gezielt beeinflussen。

Im Rahmen des von der DFG geförderten Projekts wurde ein auf Reporter-Ribozymen basierendes Verfahren entwickelt, welches die Bestimmung von Transkriptionsaktivitäten in vitro erlaubt. Die prinzipielle Anwendbarkeit des Verfahrens wurde innerhalb dieses Jahres gezeigt und publiziert [A. Jenne, W. Gmelin, N. Raffler, M. Famulok, Angew. Chem. Int. Ed. 38 (1999), 13001303]. Auf Grundlage dieses Reporter-Systems soll nun ein "High-throughput-Screening (HTS) Assay" entwickelt werden, der die schnelle, automatisierte Identifizierung von Transkriptionsinhibitoren und -aktivatoren ermöglicht. Desweiteren soll das Verfahren angewandt werden, um Mechanismen der pro- und eukaryontischen Transkription (z.B. den Einfluß von Enhancern) zu untersuchen. Der Assay besteht aus einem Ribozym-codierenden DNA-Vektor und einem Oligonukleotid-Substrat, das vom Ribozym gespalten wird. Bei Spaltung des FRET-markierten Substrats (FRET = Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) durch das Reporter-Ribozym, wird ein Fluoreszenz-Signal erzeugt, das der Menge an transkribiertem Ribozym proportional ist. Zeitabhängige Messung des spaltungsbedingten Fluoreszenzanstiegs erlaubt die schnelle, nicht-radioaktive Quantifizierung von Transkriptionsaktivitäten unter vielen verschiedenen Bedingungen. Ferner wollen wir mit dem Repaortersystem Substanzen und natürliche Interaktoren aus großen Substanzbibliotheken identifizieren, welche die Transkription gezielt beeinflussen.