Entwicklung eines automatisierten, zeitaufgelösten High-throughput-Screening Assays zur Quantifizierung von Transkriptionsraten in vitro

Im Rahmen des von der DFG geförderten Projekts wurde ein auf Reporter-Ribozymen basierendes Verfahren entwickelt，welches die Bestimmung von Transkriptionsaktivitäten in vitro erlaubt.这一原则的提出，使人们对这一问题的认识有了新的认识[A. Jenne，W. Gmelin，N. Raffler，M. Famulok，Angew. 38（1999），13001303]。在报告系统的基础上，我们将韦尔登检测技术引入到自动识别转录本和激活剂的方法中。通过对真核细胞和亲核细胞转录机制的研究，发现了一种新的韦尔登转录机制。增强剂的影响）。本试验采用一种编码DNA载体的核酶和一种寡核苷酸底物进行检测。通过报告子-核酶构建FRET标记底物（FRET =共振能量转移），可以得到一种共振信号，并使其与跨膜核酶成比例。Zeitabhängige Messung des spaltungsbedingten Schenzanstiegs erlaubt die schnelle，nicht-radioaktive Quantifierung von Transskriptionsaktivitäten unter vielen versedenen Bedingungen. Ferner wollen wir mit dem Repaortersystem Substanzen und natürliche Interaktoren aus großen Substanzbibliotheken identifizieren，welche die Transkription gezielt beeflussen.

Im Rahmen des von der DFG geförderten Projekts wurde ein auf Reporter-Ribozymen basierendes Verfahren entwickelt, welches die Bestimmung von Transkriptionsaktivitäten in vitro erlaubt. Die prinzipielle Anwendbarkeit des Verfahrens wurde innerhalb dieses Jahres gezeigt und publiziert [A. Jenne, W. Gmelin, N. Raffler, M. Famulok, Angew. Chem. Int. Ed. 38 (1999), 13001303]. Auf Grundlage dieses Reporter-Systems soll nun ein "High-throughput-Screening (HTS) Assay" entwickelt werden, der die schnelle, automatisierte Identifizierung von Transkriptionsinhibitoren und -aktivatoren ermöglicht. Desweiteren soll das Verfahren angewandt werden, um Mechanismen der pro- und eukaryontischen Transkription (z.B. den Einfluß von Enhancern) zu untersuchen. Der Assay besteht aus einem Ribozym-codierenden DNA-Vektor und einem Oligonukleotid-Substrat, das vom Ribozym gespalten wird. Bei Spaltung des FRET-markierten Substrats (FRET = Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) durch das Reporter-Ribozym, wird ein Fluoreszenz-Signal erzeugt, das der Menge an transkribiertem Ribozym proportional ist. Zeitabhängige Messung des spaltungsbedingten Fluoreszenzanstiegs erlaubt die schnelle, nicht-radioaktive Quantifizierung von Transkriptionsaktivitäten unter vielen verschiedenen Bedingungen. Ferner wollen wir mit dem Repaortersystem Substanzen und natürliche Interaktoren aus großen Substanzbibliotheken identifizieren, welche die Transkription gezielt beeinflussen.