In vitro und in vivo genetische Analyse der fdhF mRNA-Bindungsstellen des Elongationsfaktors SelB durch in vitro Selektion

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Der Elongationsfaktor SelB aus E.coli unterstützt den Einbau von Selenocystein in Selenoproteine. Bei Formatdehydrogenase H geschieht dies durch simultane Bindung an Selenocysteyl-tRNASec und ein fdhF-mRNA-Haarnadelmotiv am 3'-Ende des UGA Selenocysteincodons. Die genaue Funktion dieses mRNA-Motivs ist unbekannt. Durch in vitro Selektion isolierten wir eine große Zahl von RNA-Varianten des fdhF-RNA-Motivs, die in vitro spezifisch an SelB binden. Vier dieser RNAs wurden in einem LacZ-Fusionskonstrukt auf UGA-Durchleseaktivität in vivo untersucht. Ein Aptamer konnte die Funktion der fdHF-RNA in vivo übernehmen, die anderen drei nicht, was Rückschlüsse über mögliche Funktionen dieses RNA-Motivs erlaubte. Ziel des Verlängerungsantrags ist es, aus den selektierten SelB-Aptameren diejenigen zu identifizieren, die UGA-Durchleseaktivität in vivo aufweisen. Dies soll durch Shotgun-Klonierung in das Reporterplasmid und Identifizierung der positiven Klone erfolgen. Diese werden dann sequenziert und entsprechend ihrer Aktivität aufgelistet. Die so erhaltene "künstliche Phylogenie" der in vivo aktiven Sequenzen soll Aussagen zu Struktur/Funktionsbeziehungen des fdHF-mRNA-Motivs ermöglichen. Durch Selektion mit einer komplett randomisierten RNA-Bibliothek sollen weitere SelB-Interaktoren identifiziert werden. Detaillierte Strukturuntersuchungen der Aptamere sind ebenfalls geplant.