In vitro und in vivo genetische Analyse der fdhF mRNA-Bindungsstellen des Elongationsfaktors SelB durch in vitro Selektion

大肠杆菌的SelB延伸因子在硒蛋白中破坏了硒半胱氨酸的结构。Bei Formatdehydrogenase H geschieht通过与Selenocysteyl-tRNASec和ein fdhF-mRNA-Haarnadelmotiv am 3 '-Ende des UGA Selenocystein密码子同时结合而死亡。mRNA-动机的一般功能是不明确的。体外选择性分离是通过对fdhF-RNA-Motivs的RNA变异体进行大规模筛选，体外特异性结合SelB。维耶这些RNA在体内UGA-Durchleseaktivität的LacZ-融合体结构中产生。一种适体能在体内发挥fdHF-RNA的功能，但这三种功能都不存在，它是RNA驱动的最佳功能。Ziel des Verlängerungsantrags is es，aus den selektierten SelB-Aptameren diejenigen zu identifizieren，die UGA-Durchleseaktivität in vivo aufweisen.通过Shotgun-Klonierung进行报告质粒和阳性克隆的鉴定。这韦尔登要按顺序进行，并让他们的积极性得到加强。因此，体内激活测序的“künstliche Phylogenie”是fdHF-mRNA的结构/功能-动机。选择带有一个复杂的随机RNA-参考库，可以进行SelB-相互鉴定。详细介绍了适体的结构特征。

Der Elongationsfaktor SelB aus E.coli unterstützt den Einbau von Selenocystein in Selenoproteine. Bei Formatdehydrogenase H geschieht dies durch simultane Bindung an Selenocysteyl-tRNASec und ein fdhF-mRNA-Haarnadelmotiv am 3'-Ende des UGA Selenocysteincodons. Die genaue Funktion dieses mRNA-Motivs ist unbekannt. Durch in vitro Selektion isolierten wir eine große Zahl von RNA-Varianten des fdhF-RNA-Motivs, die in vitro spezifisch an SelB binden. Vier dieser RNAs wurden in einem LacZ-Fusionskonstrukt auf UGA-Durchleseaktivität in vivo untersucht. Ein Aptamer konnte die Funktion der fdHF-RNA in vivo übernehmen, die anderen drei nicht, was Rückschlüsse über mögliche Funktionen dieses RNA-Motivs erlaubte. Ziel des Verlängerungsantrags ist es, aus den selektierten SelB-Aptameren diejenigen zu identifizieren, die UGA-Durchleseaktivität in vivo aufweisen. Dies soll durch Shotgun-Klonierung in das Reporterplasmid und Identifizierung der positiven Klone erfolgen. Diese werden dann sequenziert und entsprechend ihrer Aktivität aufgelistet. Die so erhaltene "künstliche Phylogenie" der in vivo aktiven Sequenzen soll Aussagen zu Struktur/Funktionsbeziehungen des fdHF-mRNA-Motivs ermöglichen. Durch Selektion mit einer komplett randomisierten RNA-Bibliothek sollen weitere SelB-Interaktoren identifiziert werden. Detaillierte Strukturuntersuchungen der Aptamere sind ebenfalls geplant.