In vitro und in vivo genetische Analyse der fdhF mRNA-Bindungsstellen des Elongationsfaktors SelB durch in vitro Selektion

通过体外选择对延伸因子 SelB 的 fdhF mRNA 结合位点进行体外和体内遗传分析

• 批准号: 5217914
• 负责人: Professor Dr. Michael Famulok
• 金额: --
• 依托单位: Abteilung für Chemische Biologie
• 依托单位国家: 德国
• 项目类别: Research Grants
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 德国
• 起止时间: 1994-12-31 至 2000-12-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/5217914?language=en
• 关键词: vitro; und; vivo; genetische; Analyse

Der Elongationsfaktor SelB aus E.coli unterstützt den Einbau von Selenocystein in Selenoproteine. Bei Formatdehydrogenase H geschieht dies durch simultane Bindung an Selenocysteyl-tRNASec und ein fdhF-mRNA-Haarnadelmotiv am 3'-Ende des UGA Selenocysteincodons. Die genaue Funktion dieses mRNA-Motivs ist unbekannt. Durch in vitro Selektion isolierten wir eine große Zahl von RNA-Varianten des fdhF-RNA-Motivs, die in vitro spezifisch an SelB binden. Vier dieser RNAs wurden in einem LacZ-Fusionskonstrukt auf UGA-Durchleseaktivität in vivo untersucht. Ein Aptamer konnte die Funktion der fdHF-RNA in vivo übernehmen, die anderen drei nicht, was Rückschlüsse über mögliche Funktionen dieses RNA-Motivs erlaubte. Ziel des Verlängerungsantrags ist es, aus den selektierten SelB-Aptameren diejenigen zu identifizieren, die UGA-Durchleseaktivität in vivo aufweisen. Dies soll durch Shotgun-Klonierung in das Reporterplasmid und Identifizierung der positiven Klone erfolgen. Diese werden dann sequenziert und entsprechend ihrer Aktivität aufgelistet. Die so erhaltene "künstliche Phylogenie" der in vivo aktiven Sequenzen soll Aussagen zu Struktur/Funktionsbeziehungen des fdHF-mRNA-Motivs ermöglichen. Durch Selektion mit einer komplett randomisierten RNA-Bibliothek sollen weitere SelB-Interaktoren identifiziert werden. Detaillierte Strukturuntersuchungen der Aptamere sind ebenfalls geplant.

在硒蛋白中，伸长率selb aus e.coli是unterstütztden einbau von selenocystein。 bei格式脱氢酶h geschieht dies dies同时绑定了selenocysteyl-trnasec und fdhf-​​mrna-haarnadelmotiv am 3'- ende des uga selenocysteincodons。在体外selektion iSlieerten wir einegroßezahl von von rna-varianten des fdhf-​​rna-motivs，在体外spezifisch and selb binden。 einem lacz-fusionskonstrukt auf uga-durchleseaktivität的Vier Dieser rnas wurden in Vivo Untersucht。 Ein Apatamer Konnte Die funktion der fdhf-​​rna inVivoübernehmen，die anderen drei nicht是rückschlüsseüberMöglichefunktionen dieses rna-motivs erlaubte。 Zieldesverlängerungsantragsest es，aus den selektierten selb-appameren diejenigen zu Zu nidefizieren，die uga-durchleseaktivitätin Vivo aufweisen。在DAS reporterplasmid und sidefizierung der potitivizer-der potitived potitived klone erfolgen中死亡。 Diese Werden Dann secenziert和intsprechend ihreraktivitätaufgelistet。在体内aktiven seclenzen soll aussagen zu zu struktur/funktionsbeziehungen des fdhf-​​mrna-motivs中，死亡的“künstlichetheogenie” der der sy aktiven seclenzen solle solle soll aussagen zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu zu Durch selektion手套Randomisierten rna-bibliothek sollen weitere selb-interaktoren识别。 detaillierte strukturntersuchungen des fdhf-​​mRNA-动机学家。 Durch selektion手套是Randomisierten rna-bibliothek sollen weitere selb-interaktoren识别的关键。 detaillierte strukturntersuchungen des fdhf-​​mRNA-动机学家。