ウシにおける凍結乾燥精子ならびにガラス化卵子由来の胚盤胞作製システムの構築

奶牛冻干精子和玻璃化卵子囊胚生产系统的构建

• 批准号: 13J10439
• 负责人: 原 弘真
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: National Institute for Physiological Sciences (2014)Shinshu University (2013)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J10439/
• 关键词: 凍結乾燥; コラプス; 最大凍結濃縮相ガラス転移温度; ガラス化保存; 星状体; ROCK阻害剤 (Y-27632); α-トコフェロール; 回復培養; ROCK阻害剤(Y-27632)

細胞の常温保存を可能にする凍結乾燥は、凍結保存に代わる新たな保存方法として注目されている。本研究では、凍結乾燥サンプルの構造崩壊である「コラプス」と呼ばれる現象に着目し、精子凍結乾燥条件の最適化を図った。示差走査熱量計測定により精子懸濁液の作製に広く用いられているEGTAバッファーの最大凍結濃縮相ガラス転移温度（Tg'）を測定したところ、-45℃という非常に低い温度であることがわかった。そこでEGTAバッファーからNaClを除去し、さらにトレハロースを添加することでTg'を-28℃に上昇させることに成功した。ウシ精子を懸濁したこの修正EGTAバッファーを予備凍結した後に-30℃で乾燥したところ、コラプスの形成が抑制され、ICSI後の発生率が有意に改善された。続いて卵子のガラス化保存に関する研究においては、近年我々が報告した、ウシガラス化卵子で多発する星状体形成異常を改善することで、その発生能を改善することを目指した。ガラス化ウシ卵子の回復培養培地に抗酸化剤であるα-トコフェロールを添加して2時間培養したところ、体外受精後に星状体が複数形成されてしまう異常を示す前核期卵の割合が有意に低下した。さらに胚盤胞発生率について調べたところ、その値が無添加対照区と比べて高い値を示した。さらに本年度では、卵子の供給源であるウシ卵巣の冷蔵保存によって、そこから回収された卵子が体外受精後に同様の星状体形成異常を示すことも明らかとなり、成熟培養後の卵子にROCK阻害剤（Y-27632）処理を施すことで、この異常を抑制することに成功した。

Cell の room temperature may save を に す る は freeze drying, freezing preservation に generation わ る new た な storage と し て attention さ れ て い る. This study で は and freeze drying サ ン プ ル の structure collapse 壊 で あ る "コ ラ プ ス" と shout ば れ る phenomenon に し, sperm freezing drying conditions are の optimization を 図 っ た. Differential walkthrough heat meter measurement に よ り sperm suspension の cropping に hiroo く with い ら れ て い る EGTA バ ッ フ ァ ー の biggest freeze concentrated phase ガ ラ ス planning move temperature (Tg ') determination of を し た と こ ろ 45 ℃, - と い う temperature very low に い で あ る こ と が わ か っ た. そ こ で EGTA バ ッ フ ァ ー か ら NaCl を remove し, さ ら に ト レ ハ ロ ー ス を add す る こ と で Tg 'を - 28 ℃ に rise さ せ る こ と に successful し た. ウ シ sperm を clouding し た こ の correction EGTA バ ッ フ ァ ー を reserve freeze し た に - 30 ℃ after dry で し た と こ ろ, コ ラ プ ス の form が inhibit さ れ, after ICSI の 発 birth rate が intentionally に improve さ れ た. 続 い て eggs の ガ ラ ス turn save に masato す る research に お い て は, in recent years I 々 が report し た, ウ シ ガ ラ ス turn more eggs で 発 す る aster abnormal formation を improve す る こ と で, そ の 発 raw を improve す る こ と を refers し た. ガ ラ ス change ウ シ eggs の reply to cultivate the petty に resistance acidification tonic で あ る alpha ト コ フ ェ ロ ー ル を add し て 2 time cultivating し た と こ ろ, after in vitro fertilization に aster が plural form さ れ て し ま う nuclear period before the abnormal を shown す eggs の cut and low が intentionally に し た. さ ら に blastoderm cell 発 birth rate に つ い て adjustable べ た と こ ろ, そ の numerical が without adding the polices according to area と than べ て high い numerical を shown し た. さ ら に this year で は, eggs の supply source で あ る ウ シ eggs 巣 の cold 蔵 save に よ っ て, そ こ か ら back 収 さ れ た eggs が に after in vitro fertilization with others の aster formation abnormal を す こ と も Ming ら か と な り, mature after incubation の eggs に ROCK resistance against tonic (Y - 27632) 処 Richard を shi す こ と で, こ の unseasonably を す る こ と に into The merit is た.

项目成果

凍結乾燥ウシ精子の発生能に及ぼすコラプスの影響

塌陷对冻干牛精子发育潜力的影响

• 发表时间: 2013
• 作者: 原弘真;田切美穂;平林真澄;保地眞一
• 通讯作者: 保地眞一

Microtubule assembly and in vitro development of bovine oocytes with increased intracellular glutathione level prior to vitrification and in vitro fertilization

• DOI: 10.1017/s0967199413000105
• 发表时间: 2014-11-01
• 期刊: ZYGOTE
• 影响因子: 1.7
• 作者: Hara, H.;Yamane, I.;Hochi, S.
• 通讯作者: Hochi, S.

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保存卵巣由来のウシ前核期卵における星状体形成と胚盤胞発生との関係

牛原核期保存卵巢卵紫苑形成与囊胚发育的关系

• 发表时间: 2014
• 作者: 山口 保彦;大河内 直彦;古田雄一;原 弘真・田切 美穂・平林 真澄・保地 眞一
• 通讯作者: 原 弘真・田切 美穂・平林 真澄・保地 眞一

Adverse effect of cake collapse on the functional integrity of freeze-dried bull suermatozoa.

饼塌陷对冻干公牛精子功能完整性的不利影响。

• 发表时间: 2014
• 期刊: Cryobiology
• 影响因子: 2.7
• 作者: Hara H;Tagiri M;Hwang IS;Takahashi M;Hirabayashi M;Hochi S.
• 通讯作者: Hochi S.