ウシにおける凍結乾燥精子ならびにガラス化卵子由来の胚盤胞作製システムの構築

奶牛冻干精子和玻璃化卵子囊胚生产系统的构建

基本信息

批准号：
13J10439
负责人：
原弘真
金额：
$ 1.15万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences (2014)Shinshu University (2013)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞の常温保存を可能にする凍結乾燥は、凍結保存に代わる新たな保存方法として注目されている。本研究では、凍結乾燥サンプルの構造崩壊である「コラプス」と呼ばれる現象に着目し、精子凍結乾燥条件の最適化を図った。示差走査熱量計測定により精子懸濁液の作製に広く用いられているEGTAバッファーの最大凍結濃縮相ガラス転移温度（Tg'）を測定したところ、-45℃という非常に低い温度であることがわかった。そこでEGTAバッファーからNaClを除去し、さらにトレハロースを添加することでTg'を-28℃に上昇させることに成功した。ウシ精子を懸濁したこの修正EGTAバッファーを予備凍結した後に-30℃で乾燥したところ、コラプスの形成が抑制され、ICSI後の発生率が有意に改善された。続いて卵子のガラス化保存に関する研究においては、近年我々が報告した、ウシガラス化卵子で多発する星状体形成異常を改善することで、その発生能を改善することを目指した。ガラス化ウシ卵子の回復培養培地に抗酸化剤であるα-トコフェロールを添加して2時間培養したところ、体外受精後に星状体が複数形成されてしまう異常を示す前核期卵の割合が有意に低下した。さらに胚盤胞発生率について調べたところ、その値が無添加対照区と比べて高い値を示した。さらに本年度では、卵子の供給源であるウシ卵巣の冷蔵保存によって、そこから回収された卵子が体外受精後に同様の星状体形成異常を示すことも明らかとなり、成熟培養後の卵子にROCK阻害剤（Y-27632）処理を施すことで、この異常を抑制することに成功した。

冻干允许细胞在室温下存储，它吸引了注意力作为冷冻保存的新替代品。在这项研究中，我们专注于一种称为“崩溃”的现象，该现象是冻干样品的结构崩溃，旨在优化精子冷冻干燥的条件。 EGTA缓冲液的最大富含冷冻的相玻璃转变温度（TG'）通过差分扫描热量计的测量来测量，该温度广泛用于精子悬浮液的制备，发现非常低的温度为-45°C。因此，将NaCl从EGTA缓冲液中取出，并添加海藻糖将TG'提高到-28°C。将这种修饰的EGTA缓冲液预冻在悬浮的牛精子中，然后在-30°C下干燥，抑制了塌陷的形成，并显着提高了ICSI后的发病率。接下来，在我们关于鸡蛋玻璃化和保存的研究中，我们最近报道说，我们旨在通过改善牛玻璃化卵中经常发生的恒定发育不良来提高其发育潜力。当将抗氧化剂的α-生育酚添加到玻璃化牛卵的恢复培养基2小时时，在体外受精后的多种星状形式显着降低的前核期卵的比例会显着降低。此外，当检查胚泡发病率时，该值高于NO添加剂对照组的值。此外，今年，已经揭示了从鸡蛋中回收的鸡蛋在体外受精后通过冷藏牛卵巢的储存而表现出类似的星状发育不良，这是卵的来源，并且这种异常在与岩石抑制剂（Y-276632）中的成熟培养后成功地抑制了这种异常，从而成功地抑制了卵。