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ヒト嗅覚受容体セルアレイセンサーによるヒトにおい認識システムの解明

使用人类嗅觉受体细胞阵列传感器阐明人类气味识别系统

基本信息

批准号：
22K18343
负责人：
黒田俊一
金额：
$ 16.64万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

1)ヒト嗅覚受容体発現系の改良：今までにヒト嗅覚受容体発現で多くのシャペロンなどが検討されたが、依然として感度不足は解決されていない。今年度は、嗅覚受容体の正しい膜局在を促すシグナルペプチドを最適化した。頻用されているRhodopsinシグナルペプチドを、Lucy、リゾチーム、IL2由来ペプチド等への置換や融合を検討した。評価は嗅覚受容体応答で評価した。その結果、特定のシグナルペプチドが全ての嗅覚受容体の細胞表層発現および匂い分子応答を改善するものではないことが判明した。嗅覚受容体内部の構造に迫るアプローチが必要と推定された。２）Caイオン検出系の改良：今まではGCaMP6sを用いてきたが、検出可能な細胞内Caイオン濃度は100nM前後である。OR応答による細胞内Caイオン上昇が予想より低い可能性があるので、さらに高感度（10nM前後）なCameleonやYC2.60（GFP/RFP,やCFP/YFP融合体によるFRET検出）を検討した。その結果、低いCaイオン濃度域で作動する蛍光タンパク質を使用してもSN比が悪化することが多く、細胞内Caイオン濃度変化での検出は限界があると考えられた。３）各種阻害剤の検討：本センサーによるOR応答の定量は細胞内Ca濃度によるため、同濃度を最大化する阻害剤も同時に検討した。具体的な標的分子は、ORをリン酸化して脱感作するGRK3、cAMPを分解するPDE、Caイオン排出を行うNCX,PMCA、増加したCaイオンに応答して各種シグナル分子を抑制するCALM（カルモジュリン）とCAMKII（同依存性キナーゼ）とし、各阻害剤を単独もしくは組み合わせて検討した。その結果、PDEを阻害するIBMX、PMCAを阻害するカロキシンにシグナル増強効果が認められた。なお、GRK3阻害剤の検討は終了していない。

1) there is an improvement in the system of sniffing the recipient: today, the recipient is suffering from multiple symptoms, but it is still suffering from low sensitivity. This year, the membrane bureau is trying to improve the performance of the receptor. Use the following tools: Rhodopsin, Lucy, Lucy, IL2, and so on. She sniffed at the recipient and answered her. According to the results of the experiment, the whole body of the recipient was detected in the cell table of the specific system, and the molecules were detected in the cell table. It is necessary to presume that it is necessary to make a presumption in the interior of the receptive body. 2) the improvement of the Ca system: the current GCaMP6s uses the 100nM to determine the intracellular Ca concentration before and after the 100nM. OR responded to the question of intracellular Ca fusion (GFP/RFP, CFP/YFP fusion, FRET), low probability, high sensitivity (before and after 10nM), and high sensitivity (before and after CFP/YFP). The result of the experiment, the operation of the low Ca temperature domain, the optical emission test, the SN comparison, the intracellular Ca response, the limit test, the limit, the limit. 3) all kinds of hindrance OR: we should quantify the intracellular Ca concentration and maximize the simultaneous response of the same concentration. The specific molecular weight of CALM, the acidizing effect of OR, the effect of GRK3, the decomposition of PDE of cAMP, the excretion of NCX,PMCA of Ca, the suppression of CAMKII (homology of dependence) and the suppression of CAMKII (homodependence) by different molecular molecules, and the combination of hindrance agents. The results showed that PDE blocked the IBMX and PMCA blocked the quality of the products. The GRK3 blocked the accident and caused the loss of the price.