in-situビオチン化プロテオミクスによるタンパク質状態の定量化技術の開発

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本研究では細胞内のタンパク質状態の網羅的計測技術の開発を目的とする。ほとんどのタンパク質は細胞内で他のタンパク質と相互作用したり、リン酸化などによってその構造状態を変化させたりしていると考えられる。例えば哺乳類細胞の有糸分裂期の細胞は、細胞核膜は消失や微小菅などの細胞骨格の再構成など極めて劇的な形態変化が認められるが、このような状況下では、細胞全体にわたってタンパク質の状態変化が生じていると思われる。しかしながら、その実態を迅速かつ網羅的に見る手段は存在しない。そこで、膜透過性ビオチン化試薬を用いたin situ ビオチン化プロテオミクスを確立し、既存の相互作用プロテオミクスの手法を適用した結果と比較することで、各ビオチン化部位の変化の構造的な意義付けを行い、迅速に細胞内タンパク質状態をモニターする技術を確立を試みた。今年度は、網羅性とスループットを両立した定量プロテオミクス基盤を整備した。具体的には、data-independent acquisition (DIA)と呼ばれる手法やイオンモビリティーによる気相分離、さらにはチップ型トラップカラムを用いたハイスループットLCの組み合わせによる計測系を構築した。NHS-ビオチン試薬は膜透過性であり、細胞内に取り込まれたタンパク質上のLys残基と共有結合を形成する。この反応性がタンパク質の状態（構造や他のタンパク質との相互作用状態）に依存すると仮定している。得られた標識細胞からタンパク質を抽出し、酵素消化後にビオチン化ペプチドを高純度に精製する系を確立した(in situ biotylation proteomics: ISBP)。