in-situビオチン化プロテオミクスによるタンパク質状態の定量化技術の開発

利用原位生物素化蛋白质组学开发蛋白质状态定量技术

• 批准号: 22K19288
• 负责人: 松本 雅記
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19288/
• 关键词: プロテオミクス; タンパク質構造; 質量分析; 蛋白質構造状態

本研究では細胞内のタンパク質状態の網羅的計測技術の開発を目的とする。ほとんどのタンパク質は細胞内で他のタンパク質と相互作用したり、リン酸化などによってその構造状態を変化させたりしていると考えられる。例えば哺乳類細胞の有糸分裂期の細胞は、細胞核膜は消失や微小菅などの細胞骨格の再構成など極めて劇的な形態変化が認められるが、このような状況下では、細胞全体にわたってタンパク質の状態変化が生じていると思われる。しかしながら、その実態を迅速かつ網羅的に見る手段は存在しない。そこで、膜透過性ビオチン化試薬を用いたin situ ビオチン化プロテオミクスを確立し、既存の相互作用プロテオミクスの手法を適用した結果と比較することで、各ビオチン化部位の変化の構造的な意義付けを行い、迅速に細胞内タンパク質状態をモニターする技術を確立を試みた。今年度は、網羅性とスループットを両立した定量プロテオミクス基盤を整備した。具体的には、data-independent acquisition (DIA)と呼ばれる手法やイオンモビリティーによる気相分離、さらにはチップ型トラップカラムを用いたハイスループットLCの組み合わせによる計測系を構築した。NHS-ビオチン試薬は膜透過性であり、細胞内に取り込まれたタンパク質上のLys残基と共有結合を形成する。この反応性がタンパク質の状態（構造や他のタンパク質との相互作用状態）に依存すると仮定している。得られた標識細胞からタンパク質を抽出し、酵素消化後にビオチン化ペプチドを高純度に精製する系を確立した(in situ biotylation proteomics: ISBP)。

这项研究旨在开发针对细胞内蛋白质状态的综合测量技术。人们认为，大多数蛋白质与细胞内的其他蛋白质相互作用，并且它们的结构状态会因磷酸化等而改变。但是，没有办法快速，全面地研究实际情况。因此，我们使用膜可渗透的生物素化试剂建立了原位生物素化蛋白质组学，并将其与应用现有相互作用蛋白质组学技术的结果进行了比较，并试图建立一种技术，该技术允许在每个生物素化位点变化的结构意义并快速地监测细胞内蛋白质的状态。今年，我们建立了一个定量蛋白质组学基础，结合了综合性和吞吐量。具体而言，使用一种称为数据独立的采集（DIA），使用离子迁移率分离的方法的组合以及使用芯片型陷阱柱的高通量LC构建了测量系统。 NHS-生物素试剂是可渗透的膜，并与掺入细胞中的蛋白质上的乳糖残基形成共价键。假定这种反应性取决于蛋白质的状态（结构和与其他蛋白质的相互作用）。建立了原位生物基化蛋白质组学（ISBP），从而从所得的标记细胞中提取蛋白质，并在酶消化后将生物素化肽纯化至高纯度。

项目成果

高感度・ハイスループットプロテオミクスがもたらすタンパク質研究の新展開

高灵敏度、高通量蛋白质组学带来蛋白质研究新进展

• 发表时间: 2022
• 作者: 森俊貴;廣澤幸一朗;田口友彦;横田康成;鈴木健一;松本雅記
• 通讯作者: 松本雅記

In situ digestion of alcohol-fixed cells for quantitative proteomics

• DOI: 10.1093/jb/mvac101
• 发表时间: 2022-12-01
• 期刊: JOURNAL OF BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.7
• 作者: Hatano，Atsushi;Takami，Tomoyo;Matsumoto，Masaki
• 通讯作者: Matsumoto，Masaki

高速・高深度プロテオミクスが加速する生命科学研究

高速、深度蛋白质组学加速生命科学研究

• 发表时间: 2022
• 作者: 松本雅記

Phosphorylation of PBX2, a novel downstream target of mTORC1, is determined by GSK3 and PP1

PBX2（mTORC1 的新下游靶标）的磷酸化由 GSK3 和 PP1 决定

• DOI: 10.1093/jb/mvac094
• 发表时间: 2022
• 期刊: The Journal of Biochemistry
• 作者: Wada Reona;Fujinuma Shun;Nakatsumi Hirokazu;Matsumoto Masaki;Nakayama Keiichi I
• 通讯作者: Nakayama Keiichi I

高深度・ハイスループットプロテオミクスによるタンパク質動態研究

利用高深度、高通量蛋白质组学进行蛋白质动力学研究

• 发表时间: 2022
• 作者: Shimizu Hideyuki;Kodama Manabu;Matsumoto Masaki;Orba Yasuko;Sasaki Michihito;Sato Akihiko;Sawa Hirofumi;Nakayama Keiichi I.;松本雅記;松本雅記;松本雅記
• 通讯作者: 松本雅記