異常タンパク質蓄積による神経変性疾患発症の分子機構の解明

阐明蛋白质异常积累导致神经退行性疾病发病的分子机制

• 批准号: 18023017
• 负责人: 松本 雅記
• 金额: $ 5.31万
• 依托单位: Kyushu University (2007)Nagoya University (2006)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18023017/
• 关键词: 神経変性疾患; コビキチン; プロテオミクス; ポリグルタミン病; タンパク質分解

1) E4B遺伝子改変マウスの作製と解析E4B(-/-)ノックアウトマウスは胎生致死であった。一方、E4B(+/-)マウスはPurkinje細胞の変性を認め、運動失調(歩行障害)を示した。さらにE4Bの機能を詳細に解析するために、E4Bを神経特異的に欠損したマウス(E4B CKO)の作製を行い、行動学的解析や病理学的解析によりE4Bの機能を解析した。E4Bコンディショナルノックアウトマウス(E4B CKOマウス)は正常に発生したが、20週令までにほとんどが突然死を起こした。突然死の原因として癩癇発作が疑われたが、実際、癩癇誘発剤に対する感受性は野生型マウスと比較して明らかに高かった。2) E4Bの基質分子の探索このように、E4Bが神経変性の防御機構において極めて重要な分子であり、脳神経系におけるE4Bの基質探索の重要性が浮き彫りとなった。そこで、E4Bヘテロノックアウトマウスにおいて蓄積しているタンパク質(E4Bの基質候補)を種々のプロテオミクス技術を用いて探索を試みた。2D-DIGE法によって野生型マウスとE4Bノックアウトマウスの発現プロテオーム比較を行った。その結果、複数のスポットがE4Bノックアウトマウスにおいて増加していることが明らかとなった。これらの変動したスポットは質量分析計による同定を終え、現在、検証実験を行っている。さらに.超高感度nanoLC-タンデム質量分析計と安定同位体標識法を組み合わせることで、大規模なタンパク質の発現定量解析システムを行い、2D-DIGE法ではとらえることができなかった微量タンパク質の変動を見出した。また、E4Bの基質探索のための他の方法として、in vitroユビキチン化アッセイを用いたE4B依存的なユビキチン化タンパク質の検出システムを構築した。今後、これらの異なる手法で得られたE4B基質候補分子のリストを総合的に判断し、絞り込みを行ったうえで詳細な解析を進める予定である。

1）E4B基因​​改性小鼠E4b（ - / - ）基因敲除小鼠的生成和分析是致命的胚胎寿命。另一方面，E4b（+/-）小鼠显示出浦肯野细胞的变性，并显示了共济失调（步态障碍）。此外，为了进一步分析E4B的功能，准备了具有神经特异性缺乏（E4B CKO）的小鼠，并通过行为和病理分析分析E4B功能。 E4B有条件的敲除小鼠（E4B CKO小鼠）正常发育，但到20周，大多数猝死。尽管怀疑癫痫是猝死的原因，但实际上，对癫痫诱导剂的敏感性显然高于野生型小鼠的敏感性。 2）以这种方式搜索E4B底物分子，E4B是神经变性的防御机理中极为重要的分子，突出了E4B底物在颅神经系统中搜索的重要性。因此，我们尝试使用各种蛋白质组学技术搜索在E4B Heteroknockout小鼠中积累的蛋白质（E4B的候选底物）。通过2D-DIGE比较野生型小鼠和E4B敲除小鼠的表达蛋白质组。结果，发现在E4B敲除小鼠中增加了多个斑点。这些变量斑点已使用质谱仪识别，目前正在进行验证实验。此外，通过结合超敏感的纳米倾斜质谱仪和稳定的同位素标记方法，我们进行了大规模的定量蛋白表达分析系统，并发现了痕量蛋白变异，而痕量蛋白质变异无法通过2D-DIGE方法捕获。此外，作为底物搜索E4B的另一种方法，使用体外泛素化测定法构建了用于检测E4B依赖性泛素化蛋白的系统。将来，我们计划全面确定使用这些不同方法获得的E4B基板候选分子列表，缩小搜索范围，然后进行详细分析。

项目成果

Dynamic regulation of ubiquitination and deubiquitination at the central spindle during cytokinesis.

胞质分裂过程中中央纺锤体泛素化和去泛素化的动态调节。

• 发表时间: 2008
• 期刊: J. Cell Sci. 121
• 作者: Mukai;A.
• 通讯作者: A.

Fbxw8 Is Essential for Cul1-Cul7 Complex Formation and for Placental Development

• DOI: 10.1128/mcb.00595-06
• 发表时间: 2006-08
• 期刊: Molecular and Cellular Biology
• 影响因子: 5.3
• 作者: R. Tsunematsu;Masaaki Nishiyama;Shuhei Kotoshiba;T. Saiga;T. Kamura;K. Nakayama

Fbxw7 contributes to tumor suppression by targeting multiple proteins for ubiquitin-dependent degradation

• DOI: 10.1111/j.1349-7006.2006.00239.x
• 发表时间: 2006-08-01
• 期刊: CANCER SCIENCE
• 影响因子: 5.7
• 作者: Fujii, Yo;Yada, Masayoshi;Nakayama, Keiichi I.
• 通讯作者: Nakayama, Keiichi I.

定量的リン酸化プロテオミクスによる細胞内シグナル伝達ネットワーク解析

使用定量磷酸蛋白质组学进行细胞内信号转导网络分析

• 发表时间: 2007
• 作者: 松本 雅記;小山田 浩二;中山 敬一
• 通讯作者: 中山 敬一

M期特異的リン酸化の大規模定量解析

M 期特异性磷酸化的大规模定量分析

• 发表时间: 2007
• 作者: 松本 雅記;小山田 浩二;中山 敬一
• 通讯作者: 中山 敬一