発癌に関与するユビキチンリガーゼBRCA1の機能解析

泛素连接酶BRCA1参与癌变的功能分析

基本信息

批准号：
01J60075
负责人：
松本雅記
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ユビキチン・プロテアソーム系はエネルギー依存的に細胞内タンパク質の分解を行うシステムであり、小さなポリペプチドであるユビキチンが基質分子に鎖状に付加され、これがプロテアソームによって認識されることで特異的な基質分子の分解が可能である。本研究では発癌に関与するBRCA1などのユビキチンリガーゼの基質分子の探索を通しでユビキチン化と発癌との関係を理解することを目的とする。タンパク質のユビキチン化反応は非常に複雑なため、いくつかのモデル基質を用いたin vitroユビキチン化反応系の構築を試みた。いくつかのモデル基質の中で神経変性疾患との関連が示されているタンパク質Ataxic-3が非常に効率よくユビキチン化を受けることを見出した。そこで、Ataxin-3をモデル基質としてin vitroユビキチン化反応系を用いてAtaxin-3に対するユビキチン化関連酵素の同定を試み、VCP/E4BがAtaxin-3のユビキチン化および分解に関与することを示し、本研究内容をEMBO J.に投稿し受理された。また、BRCA1などのユビキチンリガーゼに対する基質分子を探索する手段として、細胞内でユビキチン化しているタンパク質の網羅的探索法を構築している。細胞内から抗ユビキチン化抗体を用いたユビキチン化タンパク質を濃縮し、オンラインLC-タンデム質量分析計によるショットガン解析によってユビキチン化タンパク質(およびその結合タンパク質)を数百種類同定することに成功している。現在、本方法と遺伝子ノックダウンなどを併用して基質分子の探索を行っている。

泛素 - 二蛋白酶体系统是一种以能量依赖性方式降解细胞内蛋白质的系统，当泛素（泛素（小多肽）被添加到链形式的底物分子中时，蛋白酶体可以识别这一点时，可以分解特定的底物分子。这项研究旨在通过寻找与癌变有关的泛素连接酶（例如BRCA1）的底物分子来了解泛素化和致癌作用之间的关系。由于蛋白质的泛素化反应非常复杂，因此我们尝试使用几种模型底物构建体外泛素化反应系统。我们发现，已证明与神经退行性疾病有关的多种模型底物之间的ataxic-3经历了泛素化，具有非常有效的效果。因此，我们试图使用使用Ataxin-3作为模型底物的体外泛素化反应系统来鉴定共生蛋白3的泛素相关酶，并表明VCP/E4B参与了ataxin-3的泛素化和脱位，这项研究的内容是对EMBO的接受。另外，作为搜索泛素连接酶（例如BRCA1）的底物分子的一种手段，已经构建了对细胞内泛素化的蛋白质的综合搜索方法。这些细胞已使用抗泛素化抗体从泛素化蛋白中浓缩，并通过在线LC-Tandem质谱仪通过shot弹枪分析成功地鉴定出数百种泛素化蛋白（及其结合蛋白）。当前，该方法与基因敲低和其他方法一起搜索底物分子。