リン酸化ペプチドの網羅的解析のための新技術開発

磷酸化肽综合分析新技术开发

基本信息

批准号：
18016024
负责人：
松本雅記
金额：
$ 4.86万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

1)高純度リン酸化ペプチド精製技術の確立細胞全抽出液の消化物を用いてIMAC担体や金属の選定、バッファー条件や洗浄回数などの系統的な最適化を詳細に行い、リン酸化ペプチド精製の回収率・特異性を大幅に改善した。さらに、Ga-IMACとFe-IMACのリン酸化ペプチド精製の特異性の差を見出し、この特性を利用した、tandemIMAC法を構築することでより網羅性の高い精製技術を構築した。その結果、現在、わずか100ug程度のタンパク質消化物から700種類におよぶリン酸化ペプチドに成功した。さらに、大規模なリン酸化ペプチド解析のために、種々のイオン交換クロマトグラフィー等とIMACの組み合わせを検討し、10000種類以上のリン酸化ペプチドの同定が可能となるシステムを構築した。また、ILAC法やiTRAQ法などの安定同位体標識法による定量技術を用いることで、実際にリン酸化ペプチドを定量可能かどうかを検証し、2検体間の定量的比較(SILAC法)や多検体間の比較(iTRAQ法)による定量法を構築した。2)定量的リン酸化プロテオーム解析の応用上記、定量的なリン酸化ペプチドの大規模解析システムの構築を完了したため、細胞周期やシグナル伝達研究への応用を試みた。細胞周期の解析例としては、非同調細胞とM期同調細胞の比較を行い、3000種類以上のリン酸化ペプチド(約1500種類のタンパク質に相当)の定量を行い、多数のM期特異的なリン酸化を見出した。また、EGF刺激たよって引き起こされるリン酸化の大規模定量解析をiTRAQ法との併用によって遂行し、10000種類にリン酸化の経時変化をとらえることに成功した。これらの大規模データをもとに、各々の新規リン酸化タンパク質について詳細な解析を行うとともに、文献情報とのリンクやモチーフ解析などを行うことで、細胞周期やシグナル伝達における新たな知識発見が可能であることが示された。

1）使用全细胞提取物中的消化物来建立高纯度磷酸肽纯化技术，我们对iMac载体和金属进行了详细的系统优化，缓冲液条件和洗涤次数，并显着提高了磷酸化纯化的恢复和特异性。此外，我们发现了Ga-Imac和Fe-Imac的磷酸肽纯化的特异性差异，并通过使用该特性构建串联方法，我们构建了一种更全面的纯化技术。结果，我们成功完成了700种磷酸化肽，仅从约100股蛋白质消化开始。此外，为了进行大规模的磷酸肽分析，研究了各种离子交换色谱和iMAC，以结合各种离子交换色谱和其他（例如其他），并构建了一个系统，该系统可以鉴定超过10,000种类型的磷酸化肽。此外，通过使用稳定的同位素标记方法（例如ILAC方法和ITRAQ方法）使用定量技术，我们验证了是否可以实际量化磷酸肽，并使用两个样本（SILAC方法）（SILAC方法）（SILAC方法）（SILAC方法）以及在多个样品（ITRARAQ方法）之间进行定量比较来构建定量方法。 2）应用定量磷蛋白组分析以来，已经完成了上述大规模分析系统进行定量磷蛋白组分析，我们试图将其应用于细胞周期和信号转导研究。作为细胞周期分析的一个例子，我们比较了非同步细胞和M相同步细胞，对3,000多种类型的磷酸化肽（对应于大约1,500种蛋白质）进行了量化，并发现了许多M相特异性磷酸化。此外，与ITRAQ方法结合进行了由EGF刺激引起的磷酸化的大规模定量分析，并成功捕获了10,000种类型的磷酸化的变化。基于这些大规模数据，可以表明，通过对每种新型磷酸化蛋白质进行详细分析，与文献信息和基序分析相关联，可以在细胞周期和信号传导中进行新的知识发现。