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大規模リン酸化プロテオーム解析による細胞周期制御機構の解明

通过大规模磷酸化蛋白质组分析阐明细胞周期控制机制

基本信息

批准号：
20058028
负责人：
松本雅記
金额：
$ 4.22万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までにリン酸化ペプチドの精製技術を確立した。21年度は細胞内リン酸化細胞周期の全過程の解析には少なくとも4点以上の定量が必要となるため、多検体間比較定量法を構築した。当初、一般的に質量分析計による定量法として安定同位体標識アミノ酸代謝標識法(SILAC)が主流であり、これを応用した多点定量法の構築を試みたが、使用できる培養細胞が限られるなどの欠点があるため、新規リン酸化定量プロテオミクス法であるphospho-iTRAQ法の構築を試みた。iTRAQ法は4種類,あるいは8種類の試料間の同時比較定量が可能であるため、細胞周期など時系列解析に適している。しかしながら、リン酸化の解析に適用する場合、試料の消化・リン酸ペプチドの精製後に標識を行うため、消化や精製過程での誤差が生じやすい。そこで、カゼインなどのリン酸化タンパク質を内部標準として各々の試料に少量添加することで、消化や精製の誤差を補正することを考案した。実際、実験過程で生じる誤差を内部標準由来のリン酸化ペプチドの定量値を用いて補正することが可能であった。本方法を用いて増殖因子刺激や細胞周期進行過程でリン酸化の変動を大規模に解析したところ、約10,000種類以上のリン酸化部位を同定・定量が可能であった。得られた新規細リン酸化の細胞周期制御上の意味を検証するため当該タンパク質の機能撹乱やリン酸化部位変異体の導入による細胞周期への影響の検討、さらに、細胞内局在や他のタンパク質との相互作用の細胞周期依存性等を横断的に解析している。

In the past year, the technology of acidification has been established. In 2011, the analysis of the whole process of intracellular acidification cell cycle was carried out. The quantitative method of more than 4 points was established. In the beginning, the quantitative method of general mass analysis and stable isotope identification (SILAC) was used to construct the phospho-iTRAQ method. iTRAQ method is applicable for simultaneous quantitative comparison among 4 kinds of samples and 8 kinds of samples. The analysis of the acid is applicable to the situation, the identification of the sample after digestion and purification, and the error during digestion and purification. For example, if a sample is added to a small amount of water, the sample will be digested and refined. The internal standard causes errors in the process of implementation and correction. This method uses growth factors to stimulate cell cycle progression, and allows for large-scale analysis of more than 10,000 species of acidification sites. We have demonstrated the significance of new regulation of cell cycle regulation, and analyzed the effects of cell cycle regulation on cell cycle regulation when the function of the substance is disturbed and the site of acidification is introduced.