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耐熱性,好熱性プロテアーゼ,アクアライシンIの遺伝子操作による改造

耐热、嗜热蛋白酶，通过基因操作对 Aqualysin I 进行修饰

基本信息

批准号：
61560087
负责人：
松沢洋
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アクアライシンI(aqualysin I)はグラム陰性の高度好熱性細菌Thermusaquaticus YT-1が菌体外に生産する耐熱性のアルカリ性セリンプロテアーゼである。この酵素のN末端とペプチド断片のアミノ酸配列を決定し、これに基づいて15〜17塩基からなる3本のoligodeoxyribonucleotideを合成した。これをプローブとしてT.aquaticusのDNAのPstI断片(約1.1kb)を大腸菌HB101とpUCベクターを用いてクローニングし、1,105塩基の塩基配列を決定した。この塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の1つは、終止コドンを1個も含まないopen reading frameからなり、酵素タンパク質から決定された計103残基のアミノ酸配列と一致した。化学分析によれば、アクアライシンI(成熟酵素)はN末端がAlaで、GlyをC末端とする284残基のアミノ酸からなり、分子量は約28,500である。アクアライシンIの遺伝子の成熟酵素をコードすると考えられる領域のアミノ酸配列から得られる残基数は281(分子量28,349)で、化学分析によるものと良く一致した。得られたアクアライシンIのアミノ酸配列はproteinase K、thermitase(以上はアクアライシンIと同様システインを含む酵素)、subtilisinなどのセリンプロテアーゼのものと高い相同性を示し、活性中心付近での相同性は特に高かった。大腸菌においてlacプロモータによりこの遺伝子を発現させたが、プロテアーゼ活性の上昇はみられなかった。また、高度好熱菌においてクローニングしたアクアライシンIの遺伝子を発現させることも試みたが成功しなかった。従って、本研究においては、大腸菌や枯草菌などの宿主-ベクター系においてアクアライシンIの遺伝子を発現させる系を確立することが今後の大きな課題である。それにより、本年度中には出来なかったが、遺伝子操作によるアクアライシンIの改造が可能となる。

A highly thermophilic bacterium Thermus aquaticus YT-1, a negative bacterium for aqualysin I, produces in vitro heat resistant and thermophilic bacteria. The N-terminal fragment of the enzyme is determined by the sequence of amino acids, and the base 15 ~ 17 of the enzyme is synthesized by the oligodeoxyribotide. The PstI fragment of T.aquaticus DNA (about 1.1 kb) was used to determine the nucleotide sequence of E. coli HB101 and pUC. The nucleotide sequence is determined by the sequence of residues 103 and the sequence of residues 103 is determined by the sequence of residues 103 and the sequence of residues 103 is determined by the sequence of residues 103. Chemical analysis showed that the mature enzyme had 284 residues at the N-terminal and 28,500 residues at the C-terminal, and its molecular weight was about 28,500. The number of residues in the mature enzyme of the gene was 281(molecular weight 28,349). The chemical analysis was consistent. A high degree of identity of the amino acid sequence of the amino acid sequence of the amino acid sequence E. coli strains were detected and their activity increased. The results of the test were successful. In this study, the host system of Escherichia coli and Bacillus subtilis was established, which is a major problem in the future. This year, the company will continue to improve the quality of its products.