Reinigung und Klonierung Glyoxysomaler Processing Peptidasen aus isolierten Glyoxysomen der fettspeichernden Kotyledonen von keimenden Wassermelonen

从发芽西瓜脂肪储存子叶分离的乙醛酸酶体中纯化和克隆乙醛酸酶体加工肽酶

• 批准号: 5229146
• 负责人: Professorin Dr. Christine Gietl
• 金额: --
• 依托单位: Lehrstuhl für Botanik
• 依托单位国家: 德国
• 项目类别: Research Grants
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 德国
• 起止时间: 1994-12-31 至 2005-12-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/5229146?language=en
• 关键词: Reinigung; und; Klonierung; Glyoxysomaler; Processing

Glyoxysomen aus Wassermelonenkotyledonen enthalten 4 Endopeptidasen. Sie sind als Processing Proteasen mit begrenzter Proteolyse (limited proteolysis) anzusprechen, da sie nur eine oder wenige Peptidspaltungen des Proteinsubstrates ausführen. Peptidase "A" reduziert die pre-gMDH in einem Schritt zu einem Protein mit der molekularen Masse der reifen glyoxysomalen Malatdehydrogenase (gMDH). Diese Peptidase soll zur Homogenität gereinigt und daraufhin geprüft werden, ob sie eine Processing Peptidase für höhermolekulare Vorstufen von peroxisomalen Matrix-Proteinen ist. Zum "assay" werden bei der Reinigung und zur Charakterisierung der Peptidase synthetische fluorogene Peptide eingesetzt, die die Peptidspaltstellen der Vorstufen der Malatdehydrogenase, der Citratsynthase und anderer peroxisomaler Matrixproteine abdecken. Die gereinigte Peptidase wird in Peptide gespalten und N-terminale, wie interne Peptide sequenziert. Die gewonnenen Aminosäuresequenzen werden mittels abgeleiteter Oligonukleotide zur Klonierung einer cDNA für die Peptidase "A" verwendet; die cDNA wird zur Herstellung des rekombinanten Enzymes benutzt. Die authentische Spaltung der pregMDH wird durch Radiosequenzierung ermittelt. Die höhermolekularen Vorstufen der peroxisomalen Thiolase aus Raps und Ratte lassen sich nicht mit Peptidase "A" zum reifen Enzym spalten. Es ist zu ermitteln, ob dies auf unerkannten Cofaktoren oder auf Existenz einer pre-Thiolase spezifischen Protease beruht. Die Reinigung der übrigen Processing Proteasen ("B, C und D") und die Klonierung der entsprechenden cDNAs zur Produktion der rekombinanten Enzyme ist vorgesehen, sowie eine erste funktionelle Charakterisierung dieser Enzyme.

来自西瓜子叶的乙醛酸酶抑制剂4内肽酶。Sie sind als Processing Proteasen mit begrenzter Proteolyse（limited proteolysis）anzusprechen，da sie努尔eine oder wenige Peptidspaltungen des Proteinsubstrates ausführen.肽酶“A”还原一种蛋白质中的前gMDH，该蛋白质含有大量的酰化麦芽糖脱氢酶（gMDH）分子。这种肽酶可用于匀浆和韦尔登，因为它是一种用于过氧化物酶基质蛋白质的高分子前处理肽酶。本韦尔登主要用于肽酶合成荧光肽的活性测定和特性分析，以及麦芽糖脱氢酶、柠檬酸合酶和过氧化物酶等底物的肽段分析。产生的肽酶位于肽的末端和N-末端，如内部肽的测序。氨基脲测序韦尔登可检测到用于肽酶“A”克隆的cDNA寡核苷酸;该cDNA可用于重组酶的克隆。怀孕的真实间隔将通过无线电测序进行检测。来自Raps和Ratte的过氧化物硫解酶的高分子前体不能与肽酶“A”一起作为酶的补充。这是一个很好的方法，它可以是一个简单的咖啡因，也可以是一个特殊的硫解酶蛋白酶。重组蛋白酶（“B、C和D”）的重组和重组cDNA的克隆用于重组酶的生产是一种非常有效的酶。