Reinigung und Klonierung Glyoxysomaler Processing Peptidasen aus isolierten Glyoxysomen der fettspeichernden Kotyledonen von keimenden Wassermelonen

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Glyoxysomen aus Wassermelonenkotyledonen enthalten 4 Endopeptidasen. Sie sind als Processing Proteasen mit begrenzter Proteolyse (limited proteolysis) anzusprechen, da sie nur eine oder wenige Peptidspaltungen des Proteinsubstrates ausführen. Peptidase "A" reduziert die pre-gMDH in einem Schritt zu einem Protein mit der molekularen Masse der reifen glyoxysomalen Malatdehydrogenase (gMDH). Diese Peptidase soll zur Homogenität gereinigt und daraufhin geprüft werden, ob sie eine Processing Peptidase für höhermolekulare Vorstufen von peroxisomalen Matrix-Proteinen ist. Zum "assay" werden bei der Reinigung und zur Charakterisierung der Peptidase synthetische fluorogene Peptide eingesetzt, die die Peptidspaltstellen der Vorstufen der Malatdehydrogenase, der Citratsynthase und anderer peroxisomaler Matrixproteine abdecken. Die gereinigte Peptidase wird in Peptide gespalten und N-terminale, wie interne Peptide sequenziert. Die gewonnenen Aminosäuresequenzen werden mittels abgeleiteter Oligonukleotide zur Klonierung einer cDNA für die Peptidase "A" verwendet; die cDNA wird zur Herstellung des rekombinanten Enzymes benutzt. Die authentische Spaltung der pregMDH wird durch Radiosequenzierung ermittelt. Die höhermolekularen Vorstufen der peroxisomalen Thiolase aus Raps und Ratte lassen sich nicht mit Peptidase "A" zum reifen Enzym spalten. Es ist zu ermitteln, ob dies auf unerkannten Cofaktoren oder auf Existenz einer pre-Thiolase spezifischen Protease beruht. Die Reinigung der übrigen Processing Proteasen ("B, C und D") und die Klonierung der entsprechenden cDNAs zur Produktion der rekombinanten Enzyme ist vorgesehen, sowie eine erste funktionelle Charakterisierung dieser Enzyme.