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毒素原性大腸菌耐熱性下剤毒素の受容体の構造と機能

产毒大肠杆菌热稳定性泻药毒素受体的结构和功能

基本信息

批准号：
02670177
负责人：
平山壽哉
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02670177/
关键词：
毒素原性大腸菌毒素受容体レセプタ-下痢毒素耐熱性毒素

项目摘要

STh受容体の精製とSTh受容体遺伝子のexpression cloningを行った。(1)STh受容体の精製:300匹のラットの小腸上皮細胞から刷子縁細胞膜を調製し、0.1%Lubrol PXでSTh受容体を可溶化した。この粗STh受容体を濃縮後、Sephacryl Sー300 HRカラムクロマトを行った結果、分子量200kDaを示す画分にフォトアフィニテイラベリングでSThと結合する3種類の蛋白を検出した。還元状態でのSDSーpolyacrylamide電気泳動(SDSーPAGE)では、これら3種の蛋白の分子量は53kDa、70kDa、77kDaであった。かかるST受容体の分子量の相違は、STh受容体がいくつかのサブユニットから構成されていることを示唆していた。そこで、SDSーPAGEの泳動条件を変えてST受容体のサブユニット構造を証明した。すなわち、STh受容体をSDS存在下で加熱処理もしくは還元剤処理した後に、受容体蛋白の電気泳動位置の変化を解析し、70kDaの蛋白2分子からなるSTRー200Aおよび53kDaと77kDaの蛋白それぞれ1分子からなるSTRー200Bの分子形態を明らかにした。次に、Sephacryl Sー300カラムクロマトで得たSTh受容体画分をCon A Sepharoseカラムクロマト、さらにSTをリガンドとするアフィニティコロマトグラフィによって70kDa,77kDa,53kDaの蛋白をそれぞれ精製することに成功した。現在これらの蛋白の一次構造を解析中である。(2)ラット腸管上皮細胞よりpoly(A)mRNAを調製した。これをもとにcDNAを合成してpCDM8ベクタ-にインサ-トし、Cos7細胞でのST受容体のexpresioncloningを進めている。昨年11月、GarbersらによってST受容体遺伝子のクロ-ニングの報告がなされた。この報告ではST受容体は121kDaの単一ポリペプチドである。しかし、我々の成績では、ST受容体は2量体の分子構造であり、ふたつの成績にはST受容体の分子構造に大きな相違がある。我々のNorthern Analysisの結果は、複数の受容体の存在を示唆したmRNAを検出した。

STh receptor refinement and STh receptor gene expression cloning (1) Purification of STh receptor:300 pieces of small intestinal epithelial cells were prepared, 0.1% Lubrol PX was solubilized. The crude STh receptor was concentrated, and Sephacryl S-300 HR was extracted. Three kinds of proteins with molecular weight of 200kDa were extracted. SDS polyacrylamide electrophoresis (SDS PAGE) showed that the molecular weights of the three proteins were 53kDa, 70kDa and 77kDa. The molecular weight of ST receptor is opposite to that of STh receptor, and the composition of ST receptor is different from that of STh receptor. The swimming condition of SDS PAGE is proved by the structure of ST receptor. After heat treatment in the presence of SDS, STR 200A and STR 200B molecular morphology of the 70kDa protein 2 molecule were analyzed. Sephacryl S-300 was successfully purified from STh receptor by PCR and purified from 70kDa,77kDa,53kDa protein. Now, the primary structure of protein is analyzed. (2)Poly(A)mRNA is modulated in intestinal epithelial cells. The expression cloning of ST receptors in Cos7 cells was further developed. Last November, Garbers released a report on the development of receptor DNA. This report shows that the ST receptor is a single 121kDa molecule. The molecular structure of ST receptor is different from that of ST receptor. Our Northern Analysis results indicate the presence of multiple receptors.