培養神経細胞を用いたシナプス形成とカルシウムチャネルとの関係の解析

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神経細胞は他の細胞とシナプスを形成することにより情報を伝達するが、シナプスの形成・維持は恒常的なものではなく、記憶や学習さらには神経疾患時に大きく変動することが示唆され、シナプスの可塑性と呼ばれている。本研究は、培養神経細胞を用いて、数個から十個程度の細胞で簡単なネットワ-クを構築させ、その時のシナプス形成に必要な因子を特に細胞内カルシウム濃度の調節に重要なカルシウムチャネルを中心に解析することを目的とする。(1)シナプス形成の条件の検討:ラット胎児脳の各部位を培養し、シナプスを形成する条件の検討を行った。その結果、胎児の日齢としては16〜18日目、培養する細胞密度は15〜20万cells/cm^2、培養日数は7〜10日、ポリリジンコ-トしたカバ-グラスのグリア細胞フィ-ダ-レイヤ-上に培養することが至適条件であることが明らかになった。(2)細胞内カルシウム濃度の多点同時解析:こうして得られた培養細胞にFuraー2を負荷し、340と380nmの紫外線を照射して発する蛍光比より細胞内カルシウム濃度の時間的および空間的変動が記録できた。但し、細胞体と樹状突起の両方を同時に記録する条件の設定が難しく今後の課題として残っている。培養7日目頃から多くの神経細胞で同期した細胞内カルシウム濃度の変動が記録でき、シナプスが形成されていることが明らかになった。自発的な変動以前にシナプスが形成されているかを検討するために電気刺激する条件の検討も今後の課題である。(3)単離細胞の調製:カルシウムチャネルの解析にはパッチクランプ法が最適でありが、そのためには単離した神経細胞を得る必要がある。生後ラットの脳スライスから目的部位をパンチアウトし、プロナ-ゼ・サ-モリシン処理後にピペッティングすることにより神経の単離細胞を得ることが可能になった。