^<15>N標識および変異体を利用したNMRによる酵素の作用機構の研究

^<15>利用N-标记和突变体通过NMR研究酶的作用机制

• 批准号: 03671025
• 负责人: 上杉 晴一
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03671025/
• 关键词: アデニレ-トキナ-ゼ; NMR; ^<15>N標識; 酵素; タンパク質; 基質結合部位; ATP; AMP

酵素は,あらゆる生体反応の進行に触媒として関与し,生物の最も基本的な物質である。従って,酵素の作用機構の解明は分子生物学の重要な課題である。本研究では,標的酵素として,ヒトアデニレ-トキナ-ゼおよびボヌクレア-ゼT1(RNase T1)を選び,蛋白質工学およびNMRの手法を組合せて,これらの作用機構を解明しようとしている。ヒトアデニレ-トキナ-ゼにおいては,アルギニン残基が基質の結合および触媒作用に重要な役割を果している。RNase T1においては,ヒスチジン残基が触媒作用に関与している。これらのアミノ酸は,いずれも側鎖に窒素原子を含んでおり, ^<15>NーNMRにより観察できる。これらの酵素を ^<15>N標識した誘導体およびアルギニンやヒスチジン残基をアラニン残基に変えた変異体を作成し,そのNMRを測定して各残基のシグナルの帰属を行い,ついで基質との相互作用を調べることにより,作用の分子機構を明らかにする。アデニレ-トキナ-ゼについては,遺伝子を組込んだプラスミドを大腸菌に導入し, ^<15>Nー塩化アンモニウムを含む最小培地で培養し, ^<15>N標識した酵素を調製した。このものの ^1Hー ^<15>N相関NMRスペクトルを500MHZ超伝導NMR装置で測定し,13個のアルギニン残基に対応する側鎖のεーNHシグナルを観測することができた。次いで,種を越えて保存されている6個のアルギニン残基(Argー44,97,28,132,138,149)をアラニン残基に変換した変異体を調製し,それらの ^1Hー ^<15>N相関NMRスペクトルを測定し,これらに対応するシグナルの帰属を行った。基質であるMgーATPおよびAMPを加えた時のシグナルの変化を調べ,どのアルギニン残基が結合に関与するかを分析した。RNase T1についても, ^<15>N標識体の調製を行った。

Enzymes are the most basic substances in living things. The mechanism of enzyme action is an important topic in molecular biology. In this study, the target enzyme was selected and the protein engineering and NMR methods were combined to explain the mechanism of action. The binding and catalytic effects of the residues in the matrix are important. RNase T1 is a radical that catalyzes the reaction. The nuclear, chemical and atomic components of the compound were detected <15>by NMR. The <15>enzyme is identified by the inducer, and its residues are transformed into heterogenics. NMR is used to determine the identity of each residue, and the molecular mechanism of interaction between the substrate and the molecule is clarified. In addition to the above<15>, the enzyme can be used to regulate the expression of E. coli<15>. The 1H <15>NMR spectrum of these molecules was measured at 500MHz using a superconductivity NMR apparatus. In this case, six of the six conserved amino acid residues (Arg-44, 97, 28, 132, 138, and 149) were modified with amino acid residue substitutions, and the ^1H-^<15>N-related NMR spectra were measured to determine the characteristics of these molecules. When the matrix is added, the transformation of the matrix is modulated, and the binding of the matrix residues is analyzed. RNase T1<15>

项目成果

Yoshiki Yamasaki: " ^1Hー ^<15>N 2D NMR studies on adenylate kinaseーsubstrate interaction"

Yoshiki Yamasaki：“^1Hー ^<15>N 腺苷酸激酶与底物相互作用的 2D NMR 研究”

Toshio Hakoshima: "Hydrophobic effects on protein/nucleic acid interaction:enhancement of substrate binding by mutating tyosine 45 to tryptophan in ribonuclease T1" Protein Engineering. 4. 793-799 (1991)

Toshio Hakoshima：“蛋白质/核酸相互作用的疏水效应：通过将核糖核酸酶 T1 中的酪氨酸 45 突变为色氨酸来增强底物结合”蛋白质工程。

Hitoshi Ueda: "Expression of a synthetic gene for human cap binding protein in Escherichia coli and fluorescence studies on interaction with mRNA cap structure analogues" J.Biochemistry. 109. 882-889 (1991)

Hitoshi Ueda：“人帽结合蛋白合成基因在大肠杆菌中的表达以及与 mRNA 帽结构类似物相互作用的荧光研究”J.Biochemistry。

Toshio Hakoshima: "Nonーcognizable ribonucleotide,2'AMP,binds to a mutant ribonuclease T1(Y45W)at a new baseーbinding site but not at the guanineーrecognition site" FEBS Lett.290. 216-220 (1991)

Toshio Hakoshima：“不可识别的核糖核苷酸，2AMP，在新的碱基结合位点处与突变核糖核酸酶 T1（Y45W）结合，但不在鸟嘌呤识别位点”FEBS Lett.216-220（1991）。