遺伝子発現変導を指標とした内分泌攪乱物質のスクリーニング手法の開発

以基因表达变化为指标的内分泌干扰物筛查方法的开发

• 批准号: 11878090
• 负责人: 上杉 晴一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Yokohama National University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878090/
• 关键词: ディファレンシャルディスプレイ法; 内分泌攪乱物質; 遺伝子発現; 精巣

SSDD法は短時間にRIと同等の感度で安価に行うことが出来る反面、選択的逆転写反応の特異性の低いこととそれによる偽陽性が多いことが問題点である。これらの問題点はDD法全般に当てはまる問題点といえる。従って、選択的逆転写反応を至適化することが出来れば従来法より利点のあるSSDD法の高いポテンシャルを生かすことが出来る。そこで、本年度は選択的逆転写反応の特異性を向上するための反応条件検討を行った。モデルとして精巣mRNAをTの数と3'端の異なる様々なアンカープライマー(3種類のGT15M、3種類のGT15VN、4種類のT12VN、4種類のT11VN)、3種類の逆転写酵素(AMV RTase、ReverTra Ace RTase、SuperScript RTase)、各種温度(37、40、42、45、47、50℃)で転写し、発現量の異なる3種類の遺伝子特異的プライマー(RFP,protamine1,mrp1)でPCR行い選択的逆転写が起こるかどうかを検討した。もし選択的逆転写の特異性が高ければ異なるアンカープライマー3'末端の一つで逆転写したcDNAでのみ遺伝子特異的プライマーでPCR増幅されることが期待された。結果は、50℃で逆転写した場合、protamine1遺伝子以外はPCR増幅されず逆転写されないことがわかった。さらに、低い温度で逆転写した場合には本来増幅されるべきアンカープライマーだけでなく増幅されないはずのプライマーでも増幅されこれらの条件では逆転写の選択性が低いことがわかった。これらの結果は、アンカープライマーの3'末端で選択を行うことが出来ず、これらのプライマーが容易にミスマッチを含んでペアリングする事で逆転写が進行してしまうことを示している。従って今後は逆転写反応でcDNAを分画するのではなくその後のPCR反応で厳密な選択を行うことを考えている。

SSDD method は short に RI と equal の sensitivity で Ann 価 に line う こ と が る opposite, sentaku inverse planning to write the 応 の low specificity の い こ と と そ れ に よ る false-positive が more い こ と が problem point で あ る. Youdaoplaceholder2 れら <s:1> problem points に the general DD method に when て まる まる problem points と える える える. 従 っ て, sentaku inverse planning write 応 を to optimization す る こ と が out れ ば 従 to method よ り tartness の あ る SSDD method の high い ポ テ ン シ ャ ル を raw か す こ と が る. そ こ で, this year's は sentaku inverse planning to write the 応 の specificity を upward す る た め の line against 検 応 conditions for を っ た. モ デ ル と し て fine 巣 mRNA を T の number と 3 'end の different な る others 々 な ア ン カ ー プ ラ イ マ ー (3 kinds の GT15M, 3 species の GT15VN, 4 species の T12VN, 4 species の T11VN), 3 species の inverse planning write enzyme (AMV RTase, ReverTra Ace RTase, SuperScript RTase), all kinds of temperature (37, 40, 42, 45, 47, 50 ℃) で planning write し, 発 different showing quantity の な る 3 kinds の heritage 伝 child specific プ ラ イ マ ー (RFP, protamine1, mrp1) で PCR line い sentaku inverse planning が written up こ る か ど う か を beg し 検 た. も し sentaku inverse planning write の high specificity が け れ ば different な る ア ン カ ー プ ラ イ マ ー 3 'end の a つ で inverse planning write し た cDNA で の み heritage 伝 child specific プ ラ イ マ ー で PCR rights of さ れ る こ と が expect さ れ た. Results は, 50 ℃ で inverse planning write し た occasions, protamine1 but 伝 は PCR raised outside of さ れ ず inverse planning write さ れ な い こ と が わ か っ た. さ ら に, low temperature で い inverse planning write し た occasions に は had raised picture さ れ る べ き ア ン カ ー プ ラ イ マ ー だ け で な く rights of さ れ な い は ず の プ ラ イ マ ー で も rights of さ れ こ れ ら の conditions で は inverse planning write の sentaku sex low が い こ と が わ か っ た. こ れ ら の results は, ア ン カ ー プ ラ イ マ ー の 3 'end で sentaku を line う こ と が ず, こ れ ら の プ ラ イ マ ー が easy に ミ ス マ ッ チ を containing ん で ペ ア リ ン グ す る で inverse planning written to し が て し ま う こ と を shown し て い る. 従 っ て は inverse planning to write the future 応 で cDNA を points draw す る の で は な く そ の の PCR after the 応 で 厳 dense な sentaku を line う こ と を exam え て い る.

项目成果

栗原靖之: "non-RI分子生物学実験プロトコール -蛍光ラベリング・化学発光の原理から実際まで- 「高感度蛍光色素を使ったポストステイニングによる蛍光ディファレンシャルディスプレイ法」"羊土社. 4 (1999)

Yasuyuki Kurihara：“非 RI 分子生物学实验方案 - 从荧光标记和化学发光原理到实践 - “使用高灵敏度荧光染料进行后染色的荧光差异显示方法”Yodosha.4 (1999)

明神玲子: "non-RI分子生物学実験プロトコール -蛍光ラベリング・化学発光の原理から実際まで- 「タンパク質と核酸のゲル電気泳動の高感度蛍光染色剤を使った染色法」"羊土社. 4 (1999)

Reiko Myojin：“非 RI 分子生物学实验方案 - 从荧光标记和化学发光原理到实践 - “使用高灵敏度荧光染料进行蛋白质和核酸凝胶电泳的染色方法””Yodosha 4 (1999)。